프레젠테이션

핵산 정량화는 분자생물학 워크플로우에서 중요한 단계로, 특히 qPCR 및 차세대 시퀀싱(NGS)과 같은 고급 애플리케이션의 경우 더욱 그렇습니다. NGS의 궁극적인 목표는 매우 복잡한 라이브러리를 생성하고 최대한의 깊이와 균질성으로 시퀀싱하는 것이므로 정확한 정량화가 특히 중요합니다. 핵산 농도를 정확하게 결정하기 위한 두 가지 핵심 단계는 다음과 같습니다:

1. 최대 효소 효율은 라이브러리 준비 전과 2) 시퀀싱 전 풀링을 위해 샘플을 표준화하기 위한 라이브러리 준비 후에 입력되는 DNA의 양에 민감합니다. 또한 점점 더 적은 양의 샘플을 입력해야 하고(예: RNA-seq 실험), 많은 일반적인 샘플 유형(예: FFPE 및 ccfDNA)에서 핵산을 분리해야 하는 어려움으로 인해 농도 추정이 어렵습니다.

여러 정량화 방법이 존재하지만 형광 염료 기반 시스템은 감도, 표적 선택성, 비용 및 사용 편의성으로 인해 고급 다운스트림 애플리케이션에 권장됩니다. QuantiFluor® dsDNA 시스템을 사용하면 형광 염료 원액을 희석하여 작업 용액을 만들고, 이를 소량의 정제된 DNA 샘플이 들어 있는 마이크로시터 플레이트에 추가한 다음 형광계를 사용하여 형광을 측정합니다. 민감하고 정확한 QuantiFluor® dsDNA 시스템은 단일 튜브뿐만 아니라 96웰 및 384웰 플레이트에서 dsDNA를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

소량을 반복적으로 피펫팅하는 동안 정확성을 보장하는 것은 어려울 수 있으며 이 과정은 노동 집약적이며 오류와 비용이 많이 드는 재작업이 수반됩니다. 따라서 더 높은 처리량을 필요로 하는 대부분의 실험실에서는 정량 분석을 위해 자동화된 로봇 액체 처리 플랫폼을 선택하고 있습니다.MANTIS®는 대형 시스템보다 훨씬 적은 비용으로 높은 처리량의 시약 디스펜싱에 필요한 많은 요구 사항을 충족하는 새로운 벤치탑 액체 처리기입니다. 핵산 정량화의 경우, MANTIS®는 재현 가능한 정량적 결과를 위해 소량의 QuantiFluor® 염료 작업 용액을 정확하게 디스펜싱합니다. 이 애플리케이션 노트에서는 96웰 및 384웰 플레이트 형식의 QuantiFluor® dsDNA 시스템에 대한 시약 처리를 빠르고 정확하게 자동화하는 MANTIS® 액체 프로세서의 호환성을 보여줍니다.

필수 자료

- MANTIS® 기기(포뮬라트릭스)

- 고용량 칩(포뮬라트릭스 Cat.# MCHS6)

- QuantiFluor® dsDNA 시스템(Cat.# E2670)

- 뉴클레아제가 없는 물(Cat.# P1195)

- 검은색 평평한 바닥의 96웰 플레이트(코닝 Cat.# 3915) 또는 384웰 플레이트(코닝 Cat.# 3573)

- 15ml 또는 50ml 원뿔형 튜브

- 형광 측정을 위한 멀티웰 검출기(예: GloMax Discover 시스템 [Cat.# GM3000])

실험 프로그램

시약 준비. 

1. 1X TE 버퍼 준비: 20X TE 버퍼를 뉴클레아제가 없는 물로 20배 희석합니다.

2. QuantiFluor® dsDNA 염료의 작동 용액을 준비합니다.

   a. 96웰 형식: 1X TE 버퍼에 QuantiFluor® dsDNA 염료를 1:400으로 희석합니다. 자세한 사용 지침은 QuantiFluor® dsDNA 시스템 기술 설명서 #TM346을 참조하십시오.

   b. 384웰 형식: 염료 희석은 원하는 분석 요구사항에 따라 결정됩니다. (적절한 염료 희석을 선택하는 방법에 대한 자세한 내용은 QuantiFluor® dsDNA 시스템을 사용한 고처리량, 소량 DNA 정량화를 위한 애플리케이션 노트를 참조하십시오. ) 여기서는 1X TE 버퍼에 1:200으로 희석한 QuantiFluor® dsDNA 염료를 사용하여 0.05-50ng DNA를 정량화합니다.

3. 표준 곡선 준비: 알려지지 않은 샘플의 농도 범위를 위아래로 확장하는 알려진 농도의 dsDNA 표준과 1X TE 버퍼를 사용하여 연속 희석했습니다. 블랭크 샘플의 경우 1X TE 버퍼를 사용합니다.

기기 설정.

1. MANTIS® 데스크톱 애플리케이션을 열고 파일 > 새 배포 목록을 선택합니다. 목록에서 측정 보드를 선택합니다.
   

2. 소프트웨어가 사용자에게 디스펜싱 목록에 시약을 추가하라는 메시지를 표시합니다. "시약 이름" 필드에 "QuantiFluor dsDNA"를 입력하고 완료되면 "확인"을 선택합니다.
   

3. 마이크로어레이 위치 #1에 QuantiFluor dsDNA를 할당합니다.
   

4. 마이크로어레이 위치 #1의 시약 랙에 QuantiFluor® dsDNA 워킹 용액을 놓습니다. 칩에서 시약으로 튜브를 넣습니다.

5. 원하는 구멍을 선택하고 선택한 구멍의 목표 용량을 입력하여 칩을 채우고 새로운 액체 디스펜싱을 설정합니다.

   a. 96웰 형식: 각 웰에 200µl의 작업 용액을 분주합니다.

   b. 384-웰 형식: 각 웰에 36µl의 작업 용액을 분주합니다.
   

6. 마이크로플레이트를 MANTIS®데크에 추가하고 시작을 누릅니다.

분석적 판단:

1. 표준 시료, 블랭크 및 알 수 없는 시료를 멀티웰 플레이트의 각 웰에 수동으로 피펫팅합니다.

   c. 96웰 형식: 1-20µl의 표준, 블랭크 및 알 수 없는 샘플을 추가합니다.

   d. 384웰 형식: 표준, 블랭크 및 알 수 없음 4µl를 추가합니다.

2. 플레이트 셰이커를 사용하거나 피펫팅을 통해 각 웰의 액체를 피펫팅하여 마이크로플레이트를 완전히 혼합합니다. 완전히 혼합하지 않으면 웰마다 판독값이 달라질 수 있습니다. 또한 형광을 방해할 수 있는 기포가 유입되지 않도록 하세요.

3. 실온에서 5분간 분석 시약을 배양합니다.

4. 형광(504nmEx/531nmEm)을 감지합니다. GloMax® 시스템 감지 기기를 사용하는 경우, 미리 로드된 프로토콜인 "QuantiFluor dsDNA 시스템"을 선택합니다.

5. 각 표준 및 샘플 형광에서 블랭크 샘플(1X TE 버퍼)의 형광을 제거하여 다음과 같이 dsDNA 농도를 계산합니다. DNA 표준의 보정 데이터를 사용하여 형광 대 DNA 농도의 표준 곡선을 생성합니다. 선형 또는 파워 회귀를 통해 표준 곡선에서 알 수 없는 샘플의 DNA 농도를 결정합니다.

표준화.

1. GloMax® 검출 기기의 농도 값을 MANTIS® 소프트웨어로 직접 가져와 표준화에 필요한 부피를 계산할 수 있습니다(그림 1 및 2 참조).

그림 1: 96웰 플레이트(그림 A) 및 384웰 플레이트(그림 B)에서 MANTIS® 액체 프로세서를 사용하여 QuantiFluor® dsDNA 염료 작업 용액을 디스펜싱하는 K562 인간 게놈 DNA 표준(Cat.# E4931)의 정량화. 형광은 글로맥스 디스커버 시스템에서 측정되었고 알 수 없는 샘플은 파워 회귀 표준 곡선 내에서 삽입되었습니다.

그림 2: mRNA 전사체의 평균 크기를 시뮬레이션하는 데 사용된 2,200bp PCR 산물의 정량화. 96웰 플레이트 형식(그림 A) 및 384웰 플레이트 형식(그림 B)으로 QuantiFluor® dsDNA 시스템을 디스펜싱하기 위해 Mantis 액체 프로세서를 사용했습니다. 형광은 글로맥스 디스커버 시스템에서 측정되었고, 알 수 없는 샘플은 파워 회귀 표준 곡선 내에서 삽입되었습니다.

요약

MANTIS® 액체 프로세서는 연구자에게 다양한 실험 프로토콜을 몇 분 안에 구축할 수 있는 유연한 워크스테이션을 제공합니다. 이러한 프로토콜을 정확하게 실행하여 실험실 효율성과 실험 재현성을 개선하세요. 이 애플리케이션 노트는 자동화 플랫폼으로 빠르고 원활하게 전환할 수 있는 액체 처리 소프트웨어의 사용 편의성을 보여줍니다. MANTIS® 액체 처리기를 사용하여 QuantiFluor® dsDNA 시스템에 시약을 추가하면 기기 프로그래밍이 거의 또는 전혀 없이 다층 마이크로시터 플레이트에서 재현 가능한 정량화가 가능합니다.

출처: @BostonFummerle

시간: 2022.02.15