MANTIS ® 액체 프로세서를 사용하여 마우스 신경세포 CDNA 샘플의 RNA 시퀀싱을 위한 NEXTERA XT 라이브러리 준비 간소화

프레젠테이션

다양한 고객, 샘플 유형, 시퀀싱 방법과 관련된 다양한 차세대 시퀀싱(NGS) 서비스를 제공하는 핵심 실험실은 NGS 워크플로우의 효율성과 생성하는 데이터의 품질 간의 균형을 유지해야 합니다. 시퀀싱 비용이 감소함에 따라 라이브러리 준비와 관련된 비용이 전체 NGS 워크플로우 비용의 큰 부분을 차지하기 시작했습니다. 시퀀싱의 이러한 주요 비용 문제를 해결하기 위해 많은 조직에서 반응 소형화 추세를 따라 반응량을 제조업체의 권장량인 10%로 효과적으로 줄였습니다.

이 애플리케이션 노트에서는 적은 세포 투입량에서도 정밀한 포지티브 변위 미세유체 시약 디스펜싱을 통해 고품질 NGS 라이브러리를 생성하는 워크플로우를 중점적으로 설명합니다. 4분의 1 부피의 일루미나 넥테라 XT 라이브러리 준비에서 얻은 품질 관리 데이터는 단일 세포 시퀀싱의 맥락에서 반응 소형화의 적용 가능성과 효과를 보여줍니다.

Material.

  • 에펜도르프 트윈텍 384 플레이트(PN 0030129342)
  • 일루미나 넥테라 XT DNA 라이브러리 준비 키트(PN FC-131-1096)
  • 일루미나 넥테라 XT 인덱스 키트 V2(FC-131-2001)
  • 열 사이클러
  • 포뮬라트릭스® 맨티스® 리퀴드 프로세서(PN MANTV3.2)
  • 알파쿠아 384 컬럼 마그네틱 플레이트(PN A001222)
  • 써모피셔 큐비트 4 형광 측정기(PN Q33226)
  • 애질런트 2100 바이오애널라이저(PN G2939BA)

방법론

쿼터 볼륨 일루미나 넥테라 XT 라이브러리 준비

이 파일럿 프로젝트에는 8개의 마우스 신경세포 cDNA 샘플(세 가지 세포 유형, 1ng의 입력 DNA)이 사용되었으며, 다음 실험 프로토콜에 따라 분기별로 생성된 라이브러리의 품질을 평가했습니다:

**A. 태그먼트 cDNA - 총 반응량 6.35µL **

  1. 384웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 1.25µL의 입력 DNA를 추가합니다.

  2. TD 버퍼를 200µL 피펫 팁*에 넣고 MANTIS의 LV 칩 위에 놓습니다. 샘플이 들어 있는 MANTIS 마이크로플레이트의 각 웰에 2.5µL의 TD 버퍼를 분주합니다.

  3. 믹스.

  4. ATM을 200µL 피펫 팁*에 피펫팅하고 MANTIS의 LV 칩 위에 놓습니다. MANTIS 마이크로플레이트의 샘플이 들어 있는 각 웰에 1.3µL의 ATM을 분주합니다.

  5. 믹스.

  6. 열 순환.

    i. 55°C에서 5분간 유지합니다.

    그 이후에는 항상 10°C를 유지합니다.

  7. NT 버퍼를 200µL 피펫 팁*에 피펫팅하고 MANTIS의 LV 칩 위에 놓습니다. 샘플이 들어 있는 MANTIS 마이크로플레이트의 각 웰에 1.3µL의 NT 버퍼를 분주합니다.

  8. 믹스.

  9. 실온에서 5분간 배양합니다.

B. 라이브러리 증폭 - 총 반응량 12.65µL

  1. 200µL 피펫 팁*에 NPM을 흡인하고 MANTIS의 LV 칩 위에 놓습니다. MANTIS 마이크로플레이트의 샘플이 들어 있는 각 웰에 3.8µL를 분주합니다.

  2. 두 인덱스 프라이머의 1.25µL를 시료에 수동으로 피펫팅하여 각 시료에 대한 고유한 인덱스 프라이머 조합을 얻습니다.

  3. 믹스.

  4. 열 순환.

    i. 72°C에서 3분

    95°C에서 30초

    iii. 다음 12주기를 수행합니다.

    a. 95°C에서 10초

    b. 55°C에서 30초

    c. 72°C에서 30초

    iv. 72°C에서 5분

    v. 항상 10°C

C. 라이브러리 정리

1. 200µL 피펫 팁*에 AMpure XP 마이크로비드를 흡입하고 MANTIS의 HV 칩 위에 놓습니다. 샘플이 들어 있는 각 웰에 10µL를 MANTIS 마이크로플레이트에 분주합니다.

2. 믹싱.

3. 실온에서 5분간 배양합니다.

4. 접시를 자석 위에 놓고 2분간 기다립니다.

5. 모든 상층액을 수동으로 제거합니다(11단계까지 자석에서 마이크로플레이트를 제거하지 마십시오).

6. MANTIS의 연속 흐름 기능 옵션을 사용하여 마이크로플레이트의 시료가 들어 있는 각 웰에 80% EtOH 50µL를 추가합니다.

7. 30초간 인큐베이션합니다.

8. 마이크로플레이트를 자석 위에 올려놓으면서 상층액을 모두 수동으로 제거합니다.

6-8단계를 반복합니다. 1. 15분간 자연 건조합니다. 2. 2. 자석에서 마이크로플레이트를 제거합니다. 3. 200µL 피펫 팁*에 RSB를 피펫팅하고 MANTIS의 HV 칩 위에 놓습니다. 4. MANTIS 마이크로플레이트의 샘플이 들어 있는 각 웰에 15µL를 분주합니다. 5. 혼합합니다. 6. 실온에서 2분간 배양합니다. 7. 마이크로플레이트를 자석 위에 놓습니다. 8. 2분간 배양합니다. 9. 비드에서 새 마이크로플레이트에 12.5µL를 수동으로 옮깁니다.

D. 흡입량 = 시료당 분주량 x 시료 수 + 10% 안전 계수. 흡입량이 200µL 이상인 경우 1000µL 피펫 팁을 사용하십시오.

결과.

각 샘플에 대해 애질런트 바이오애널라이저 추적을 통해 넥스테라 라이브러리 품질을 평가했습니다.

그림 1: 8개의 고유한 1ng 마우스 신경세포 cDNA 샘플로부터 준비된 8개의 차세대 시퀀싱 라이브러리의 바이오널라이저 트레이스.

요약.

BioAnalyzer 데이터 추적에 따르면, 1/4 부피 반응 소형화로 준비된 라이브러리의 구성은 허용 가능하며 전체 부피 실험 프로토콜에 따라 준비된 것과 비슷합니다.

라이브러리를 4분의 1 부피로 준비하면 반응당 키트 비용을 75%까지 크게 절감할 수 있습니다. MANTIS® 액체 처리기는 최소 100 nL의 정밀한 미세 유체 시약 분주를 통해 반응 소형화를 촉진하며 소모품이 필요 없고 사용이 간편하며 신뢰할 수 있는 제품입니다.

 

출처: @BostonFummerle

날짜: 2022년 2월 10일