蛍光寿命測定におけるいくつかの重要な問題
中国科学院大連化学物理研究所の金勝渓氏
蛍光寿命検出は、物質の励起状態寿命とキャリアキネティクスを決定するために用いられる最も一般的な技術の1つである。蛍光寿命検出技術の正しい選択と使用、および蛍光寿命カイネティックスの正しい取得と解析は、物質の励起状態特性、材料特性、キャリアカイネティクスを決定する上で特に重要である。これまで、蛍光寿命検出装置の技術パラメータや速度論的解析に誤解や勘違いがあり、研究対象物質のキャリア速度論的特性を誤って判断してしまうことがしばしば見受けられた。そこで、この短い記事で、蛍光デバイスの重要な技術パラメータの物理的意味と速度論的理解について簡単に紹介したいと思います。
01蛍光寿命の基本原理
蛍光とは、発光物質がエネルギー準位軌道で電子の跳躍を起こした後に励起光子を吸収し、光子による放射複合化の過程で励起状態種（励起子、自由電荷など）を生成することをいう。蛍光は、物質が基底状態から励起状態に変化し、その後崩壊して基底状態に戻る過程を表しており、蛍光寿命はその物質の励起状態の寿命を反映している。この過程を分子Cを例にとって説明する：
基底状態のC分子は、励起光子を吸収して励起状態C*に変化し、励起状態Cは、放射光（kr）または非放射光（knr）のいずれかの経路で基底状態に崩壊して戻ることができる。一次反応速度式によれば、励起後の瞬間tで、Cの減衰率が高い。
時間をかけて積分すると、瞬間tにおけるC*の濃度は次のようになります。
ここで、C0*はt=0の瞬間の励起状態の全濃度（つまり励起によって生じた励起状態の全濃度）、k0=kr + knrとする。
蛍光寿命検出実験では、検出器は単位時間あたりの発光強度すなわち試料の発光速度d(photon)/dt、したがって、これを検出する：
現実的な検出プロセス（例えば、時間相関単一光子計数（TCSPC）技術を使用）では、検出器は、Δtが十分に小さい場合、小さな期間（ビン時間、Δt）の光子数（ΔP）を収集することによって実際に発光率を決定する：
実験的に収集された蛍光寿命曲線は、図1に示すことができます。
図1.典型的な蛍光寿命曲線の模式図
蛍光寿命曲線全体は、連続するΔt（ビン時間）間隔のΔP値で構成され、主に立ち上がりエッジ（励起状態の形成）と立ち下がりエッジ（励起状態の減衰）で構成されています。立ち上がりエッジは、励起のメカニズム（直接励起やエネルギー移動など）とIRF（機器応答関数）によって決定される。機器のIRFは、後で説明するように、蛍光寿命検出の時間分解能を決定する。蛍光寿命の減衰成分は、式(4)で表すことができる。この減衰曲線を指数関数的にフィッティングすることで、試料の蛍光減衰速度定数k0または蛍光寿命τ0＝1/k0が得られる**。このことから、蛍光寿命検出で得られる蛍光寿命τ0は、放射複合体のみの速度定数ではなく、励起状態におけるすべての減衰チャンネル（放射・非放射）の速度定数の和であることがわかる。また、減衰曲線フィットのA0は、t=0の瞬間に実験室で測定されたΔp値（光子数）である。式（4）により、A0は、A0＝krC0であるべきであることが導かれる。 (検出器の光子検出効率はここでは考慮しない）。選択された試験試料では、kr（放射線錯体速度）は安定した条件下で定数とみなすことができるので、減衰曲線におけるA0は、特徴的なk0減衰定数を持つ試料中の励起状態の総濃度C0に比例すると考えることができる。
上記の模式的説明では、単指数減衰式を例にしています。しかし、実際にはほとんどの試料が二重、あるいは三重の指数関数的な減衰過程を示しています。私は、複数の指数関数的減衰過程が存在するのは、空間的・時間的スケールでのサンプルの非均質性に起因すると考えています。空間的な非均質性とは、巨視的なサンプルに含まれる多数の発光個体（個々の分子や個々のナノ粒子など）間の差異（個体自身やその微視的な環境）を意味します。試料に含まれる1つの発光個体に対して、それが存在する微視的環境は、例えば、欠陥状態の分布が均一でない、温度が均一でない、表面界面が均一でないなど、大きく異なる場合があり、その結果、試料中の発光個体のk0は全く同じではなく、分布があり、マクロな試料の蛍光寿命曲線には多数の個の平均後の多指数減衰過程を反映している。また、蛍光寿命の取得過程においても、環境条件の変動や特定の物理過程の発生により、試料は取得の瞬間ごとに異なる蛍光寿命を示し、最終的な蛍光寿命曲線は多指数過程を示すことになる場合がある。式（5）の多重指数方程式を当てはめることで、異なる蛍光寿命成分の蛍光寿命値（k1、k2 ...）と、全体の寿命曲線（A1、A2 ...）に対する各成分の寄与を以下のように導出できる：
また、上記の説明は、励起状態種を全体（例えば、単一の線状状態や励起子）として扱う一次反応（e指数）の観点である。もし、発光が自由電子と正孔の複合体によって生じるのであれば、蛍光寿命減衰曲線は2次反応（べき指数）で表現する必要がある、つまり
運動過程は複雑なので、ここでは説明しないが、関連する研究については対応する文献を参照されたい。
02蛍光寿命検出の技術原理
時間相関単一光子計数法（TCSPC）は、現在最も広く使われている蛍光寿命試験法である。まず、蛍光寿命曲線が多数のフォトンカウントの結果であることは明らかであろう。巨視的な（バルク）試料が1回の励起で1000個の励起状態を生成すると仮定すると、この1000個の励起状態の発光を励起後の異なる遅延時間で検出器が記録すれば、その試料の蛍光寿命曲線が得られることになる。TCSPCは、単一光子統計の概念に基づき、パルスレーザー、高感度光子検出器、TCSPCカードで構成され、その原理は図2に示すとおりである。レーザーパルスは試料を励起して励起状態を作り出し、その後、時間t1に蛍光光子の複合発光が起こり、それが検出器に捕捉される。t1時刻は、その励起に対するレーザーパルス信号とTCSPCで記録された蛍光信号の時間差（微小時間）である。しかし、TCSPC検出では、全てのレーザーパルスが収集すべき蛍光光子を生成できるわけではない（試料蛍光の量子効率や装置の取得効率などの要因によって制限され、例えば検出器が記録する単位時間当たりの光子数（counts/s）は、通常レーザー再頻度に比べて1〜2桁低い）ので、蛍光光子生成のマイクロタイムのみを記録するために（多くのメモリを節約できる）、TCSPCカードは蛍光光子の記録を行う。TCSPCカードは、蛍光信号とそれに隣接する次のレーザーパルス信号との時間差（図2のt1′）を記録し、レーザーパルス時間周期T（Tは選択したレーザー再周波数で固定）に基づき、t1＝T-t'1を得ることができる。 次に、収集した多数の光子（t1、t2、t3 ...）のマイクロタイムは、次のようにして評価する。蛍光寿命曲線は、大量に集められた光子の微小時間（t1、t2、t3 ...）をカウントすることで得られる。
図2 TCSPCの蛍光寿命検出原理
a：TCSPCカード時間記録の原理、b：個々の光子時間を統計的にカウントして蛍光寿命曲線を構築、c：TCSPC蛍光検出器構造の模式図
TCSPCライフタイムカーブにおける蛍光フォトンの微小時間統計は、チャンネル数に基づいている。取得時間窓を100ns、チャンネル数を4096とすると、蛍光寿命曲線における時間軸の点間隔は100ns/4096＝24.4psとなり、図1、図2のビン時間（△t）となり、蛍光寿命曲線における時間軸の点数は0, 24.4, 48.8, 73.2 --- となる。蛍光寿命曲線は、各フォトンの微小時間に基づいて、各△t区間におけるフォトン数をカウントすることで構築される。TCSPCの取得原理から、この方法は通常高い時間分解能で使用することができ、高いレーザーリフリケンシーでの使用に適している。レーザー周波数が低い場合（例えば＜1KHz）、蛍光寿命の収集効率が悪くなる（単位時間あたりの光子の数が少なくなる）。特に注意したいのは、この⊿t（ビンタイム）時間は、蛍光寿命プローブの時間分解能ではなく、あくまでもTCSPCカードのタイミング精度を表していることです！
また、TCSPCアッセイにはマクロ時間という概念があり、これは実験取得の開始時点に対して蛍光フォトンが記録される時間であり、蛍光寿命におけるフォトンミクロ時間とは根本的に異なる。 TCSPCカードはフォトンミクロ時間（時間差）を10ps以下の精度で検出できるが、マクロ時間は通常マイクロ秒オーダーでの精度で記録する。
上記原理に基づくTCSPC蛍光検出器の基本構造は図2cに示すことができ、主にレーザー、検出器、TCSPCカードなどのコアコンポーネントを含む。レーザーと検出器は、レーザー光の発光と光子の検出時に同期した電気信号を出力し、TCSPCカードで検出され、各蛍光光子のマイクロタイムとマクロタイムを求めて計算し、蛍光寿命曲線を構築する。
また、蛍光寿命取得では、蛍光寿命曲線が時間窓の0から始まらず、遅延時間Tdを持つこともよくある（図3に示す）。電子機器の応答時間や回線における電気信号の伝送時間により、同期する電気信号と実際の光信号との間に固有の時間差が生じ、その結果、蛍光寿命のタイムウィンドウに遅延が発生する。この遅延は、蛍光寿命の取得には影響しないが、時間窓の範囲の利用を減少させる。遅延時間の大きさは、電気伝送路の長さを変えるか、電気遅延パラメータを設定することで調整することができます。
図3 蛍光寿命取得の遅延とその原因
TCSPC技術に加えて、オシロスコープでも蛍光寿命の取得が可能である。オシロスコープは、1回のパルス励起で最大1個の光子時間を記録するTCSPCとは異なり、1回のパルス励起後の蛍光強度を高速で連続取得し、蛍光寿命曲線を得ることができる。時間スキャンの精度は、オシロスコープの帯域幅（サンプリングレートではない）で決まる。例えば、帯域幅500Mのオシロスコープでは、TCSPCを大きく下回る2nsの精度の時間掃引を実現できるが、それ以上の帯域幅（例えばGHz以上）のオシロスコープは非常に高価である。したがって、帯域幅の制限から、オシロスコープ方式は、蛍光寿命の長いサンプル（燐光など）や低いレーザー再周波数の条件下での検出に適していることがほとんどである。
03蛍光寿命検出のコアパラメータ
蛍光寿命の正確な取得と解析を実現するためには、まず蛍光検出における多くのコアパラメータ（主に時間分解能、時間窓範囲、時間精度など）を定義する必要があります。
1）時間分解能とIRF（Instrument Response Function）。
時間分解能は、蛍光寿命測定技術において最も重要なパラメータであり、検出システム（レーザー、検出器、TCSPCカードを含む）全体の機器応答関数（IRF）で決定される。**IRFは、レーザー、検出器、TCSPCカードの電気信号の応答時間やジッター、レーザーのパルス幅によって決定されます。TCSPCカードでは、タイミング精度は<10psに達することができ、これは通常、レーザーや検出器の精度よりもはるかに高い。したがって、TCSPC蛍光検出システムのIRFは、主にレーザーと検出器に由来しています。
レーザーの場合、IRFの主な要因は、図4に示すように、レーザーのパルス幅と同期する電気信号のジッターです。レーザーのパルス幅は、パルスレーザーの最も重要なパラメータの一つで、時間的に広がったパルスのFWHM（全幅半値）値で表されます（図4）。また、TCSPCカードは、レーザーのパルス同期電気信号（SYNC）を取得することで、レーザーの再周波数と周期時間Tを取得しますが、各パルス電気信号間には時間ジッターが発生し、すなわち電気信号のパルス周期は正確なT時間ではなく、T＋ジッター時間となっています。蛍光光子の微小時間計算（図2のt1、t2）t1＝T-t'1によれば、時間Tのジッターは（たとえTよりはるかに小さいとしても）時間t1に持ち越され、したがって機器の対応機能に寄与する。
図4 IRFへのレーザーの寄与、主にレーザーパルス幅と同期電気信号の時間ジッター(Jitter)によるもの
現在、TCSPCプロービングに使用されているレーザーのパルス幅は、fs、ps、nsから選択することができます。同期電気信号のジッターは、通常100psのオーダーである。レーザーパルス幅がジッターよりはるかに大きい場合（例えばnsレーザー）、IRFの寄与は主にパルス幅から、ジッター時間がレーザーパルス幅よりはるかに大きい場合（例えばfsレーザー）、IRFの寄与は主にジッターから、両者が近い場合（例えばpsレーザー）、複合効果であることがわかります。
検出器の場合も、上記と同様に検出器の応答時間や電気信号のタイムジッターの問題がある（図5参照）。検出器が光子を検出すると、対応する電気パルス信号を出力するが、その立ち上がりエッジが検出器の応答時間（経過時間）を表す。TCSPC検出では、有効な電気パルスを識別するために信号閾値（TH）を設定し、これを正確に記録すると、一定割合の弁別器により、強度の変動に関係なく、光子が検出器に到着した正確な時刻を記録します。検出器の通過時間自体は原理的に装置のIRFに寄与しないが、繰り返し光子を検出する際、同じ瞬間でも検出器に到着した光子については、電気出力信号の時間的分布や互いのずれ、すなわち過渡的な時間広がり（図5参照）が生じ、検出器の時間ジッターとなる。ジッター）が発生し、システム全体のIRFに寄与する。
図5 検出器のタイムジッターのIRFへの寄与。検出器は光子を検出してパルス状の電気信号を発生させるが、光子が検出に達する時間は、設定された電気信号の閾値によって決定される。そして、通信信号の電気信号の時間ジッターは、遷移時間展開（ジッター）の存在によって発生します
現在、商用機器では、単一光子検出器やPMTなどの検出器が主に使用されており、単一光子検出器のジッターは通常100ps以下に達するものが多く、従来のPMT検出器は1～2nsのジッターに達し、特殊なマイクロチャネルプレート（MCP）PMTやハイブリッドPMTは100ps以下に達することができます。したがって、筆者の意見では、このシステムが従来のPMT検出器を使用する場合、より長い蛍光寿命のサンプルの検出にのみ適していると思われる。
このことから、蛍光寿命システムの全体的なIRFは、レーザーと検出器から構成され、その値は以下の理論式で決定することができることがわかります：
IRF値は，測定されたIRF曲線のFWHM値として定義することができる。IRF値が小さいほど，装置の時間分解能が高いことを示す。
図6 蛍光寿命検出装置のIRF
したがって、本実験で測定した蛍光寿命曲線は、IRFと蛍光信号の畳み込み（分解能）の結果である（図7a）。**IRFは蛍光寿命検出の時間分解能を直接決定するため、その大きさは蛍光寿命取得の結果や解析に大きな影響を与える。実験操作の前に、デバイスのIRFのサイズが検査する試料の蛍光寿命の測定に適しているかどうかを判断する必要がある**。図7bに示すように、同じサンプルに対して、IRFが小さいデバイスは立ち上がりが速くシャープなプロセスを示し、IRFが大きいデバイスは立ち上がりが遅くスムーズなプロセスを示す。蛍光寿命の減衰過程に高速減衰成分が含まれている場合、IRFが小さいデバイスのみが高速成分を効果的に拾い上げることができる（IRFが高速成分の寿命より小さい）が、IRFが大きいデバイスは、時間分解能の制限により、高速減衰成分の存在を検出できない可能性が高く（例えばIRFが高速減衰成分の寿命よりはるかに大きい場合）、結果として、著しいこのため、結果の解析に大きなバイアスがかかることがある。例えば、蛍光寿命を調べることで、試料中の欠陥状態の濃度を判断することが一般的である。試料中の欠陥状態の濃度が高いと、蛍光寿命が急速に減衰するため、IRFが大きいデバイスで蛍光を収集すると、起こりうる急速な減衰過程の検出ができず、試料中の欠陥状態濃度を正しく判断できない可能性が高い。また、試料中の電荷移動、エネルギー移動などの過程や、ある種の分子や半導体材料も、蛍光を発生させたり、急速減衰過程を持つことがあり、このような過程や材料の蛍光速度論的研究も、IRFが小さい蛍光寿命検出装置を用いて行う必要がある。
図7 a) 実験で測定された蛍光寿命曲線は，IRFと蛍光信号の畳み込みの結果である。 b) IRFの大きさが蛍光寿命曲線に与える影響 IRFが大きいデバイスでは，時間分解能に限界があり，蛍光寿命減衰の速い成分を検出できない可能性がある。
蛍光寿命がIRFより小さいサンプルでは、データフィッティングの際にデコンボリューションを行うことで、蛍光寿命を抽出することができます。シミュレーションにより、デコンボリューションはIRF/5までの蛍光寿命を正確に抽出できることがわかりました（例えばIRF=200psの場合、デコンボリューションは〜40psと高速でフィッティングできます）。現在、一部の市販装置メーカーは、デコンボリューションの外挿限界をIRF/10に設定し、それを装置の時間分解能と定義していますが、これは誇張されており不正確であると私は考えています。結局のところ、デコンボリューションの結果は精密な検出ではなく数学的手法から導かれたものであり、IRF未満の蛍光寿命についてはおおよその推定しかできない。より正確な検出は、超高速蛍光アップコンバージョンや超高速ストリークカメラなど、より時間分解能の高い検出装置を用いることで実現できるはずです。
また、蛍光寿命検出技術の時間分解能は、蛍光寿命曲線のビン時間（図1の△t）やTCSPCカードのマイクロタイミング精度ではなく、システム全体のIRF時間によって決まることを再認識しておく必要がある。**レーザーと検出器のIRFは通常、TCSPCのタイミング精度よりもはるかに大きいので、システム全体のIRFはレーザーと検出器によって制限される。
現在、市販されている蛍光寿命検出装置は、レーザーや検出器が異なるなど、構成が選べるようになっています。まとめると、時間分解能のパラメータについては、機器構成を選択する際に以下の点に着目する必要がある：
- レーザーのパルス幅はどのくらいか
- レーザー同期信号のジッター時間
- 検出器ジッター時間
- TCSPCカードのタイミング精度やチャンネル数に関する情報
システムの最終的なIRFは、上記パラメータにおける最大時間値以上となる。
2) 検出時間窓とレーザーの再周波数
TCSPCの蛍光寿命検出における時間窓範囲は主にレーザー発振周波数に依存し，最大時間窓はレーザー発振周波数Tのサイクルタイムとなるが，図3に示す電気信号伝達の遅延により，時間窓範囲の一部は遅延時間で占められている。一般的に、時間窓範囲は蛍光寿命の2〜3倍以上になるように選択する必要があると言われており、試料の蛍光寿命に応じて適切なレーザー反射周波数の選択、電気信号の遅延時間などを調整する必要がある。また、TCSPCが蛍光寿命曲線のビン時間（△t）をチャンネル数を時間窓の範囲で割って決定する場合、時間窓が大きいとビン時間の値が大きくなり（例えば△t≒または＞IRF）、システムの時間分解能の低下につながる。
一方、TCSPCのシングルフォトンカウンティング取得法では、再周波数が低すぎるレーザーを使用すると、単位時間当たりに取得される光子数が少なくなり、蛍光寿命曲線の取得効率やS/N比が著しく低下する。
04蛍光寿命曲線の正しい表示
前述のように、完全な蛍光寿命曲線は、立ち上がりエッジと立ち下がりエッジを含む必要があります。両成分は物理的に重要である。蛍光寿命データの文献では、立ち上がりエッジを省略した表現がよく見られますが、これは本質的に正しくないアプローチです。立ち上がりエッジは試料中の励起状態生成過程を表し、直接励起された発光種では検出時のIRFの大きさを反映し、蛍光寿命曲線に高速減衰成分が欠けているかどうかを判断したり、図8に示すように試料によってはエネルギー移動（または他の励起状態生成過程）などの過程を観測するために使用できるため、十分に注意を払う必要がある。もちろん、蛍光寿命がIRFよりはるかに大きい場合や、高速過程に興味がない場合は、この時点の立ち上がりエッジを無視することも可能である。また，より正確な蛍光寿命フィッティング結果を得るためには，（特に蛍光寿命が短い場合には）蛍光寿命曲線フィッティングにおいてIRFを考慮する必要がある。
図8 ドナー・アクセプター共鳴エネルギー移動中の両者の蛍光寿命曲線を収集することで、エネルギー移動のキネティクスを決定することができる。エネルギー移動時間＞IRFの場合、アクセプターの蛍光寿命曲線はIRFよりも遅い立ち上がりエッジを示し、それに伴ってドナーの蛍光が急速に減衰する。
出典：トライスタースペクトラム＠WeChat
WHENです：2022-04-19