荧光寿命检测中的若干关键问题
金盛烨，中科院大连化学物理研究所
荧光寿命检测是用于判断物质激发态寿命和载流子动力学过程的常用技术之一。如何正确选择和使用荧光寿命检测技术以及正确采集和解析荧光寿命动力学，对我们判断物质的激发态性质、材料性质及载流子的动力学过程尤为重要。在过往的科研研究中，我们经常会发现人们在荧光寿命检测设备的技术参数和动力学解析中存在着某些理解上的偏差和误区，从而导致对所研究材料载流子动力学性质的错误判断。因此，我们希望通过此短文简要介绍荧光设备某些重要技术参数的物理意义和动力学过程的理解。
01荧光寿命的基本原理
荧光是发光材料吸收激发光子之后发生能级轨道上的电子跃迁，产生的激发态物种（如激子、自由电荷等）通过辐射复合的方式发出光子的过程。荧光体现了材料由基态变为激发态并随后衰减回基态的过程，其荧光寿命体现了材料激发态的寿命。我们以分子C为例来说明这一过程：
基态C分子吸收激发光子后变为激发态C*，激发态C可以通过辐射发光（kr）或者非辐射发光（knr）的途径衰减回基态。按照一级反应速率方程，在激发后的t时刻，C的衰减速率为：
对时间积分可以得到t时刻C*的浓度为：
其中C0*为t=0时刻的激发态总浓度（即激发产生的激发态总浓度），k0= kr + knr。
在荧光寿命检测实验中，检测器检测的是单位时间发光强度即样品的发光速率，d(photon)/dt，因此：
在现实检测过程中（例如利用time-correlated single photon counting (TCSPC)技术），由于受到设备时间精度的限制，检测器实际上是通过收集一小段时间（bin time，Δt）内的光子数（ΔP）来判断发光速率, 当Δt足够小时：
其中A0 =krC*0。实验采集的荧光寿命曲线可如图1所示。
图1. 典型荧光寿命曲线示意图
整个荧光寿命曲线是由连续的Δt（bin time）间隔的时间点下的ΔP值组成的，主要包括上升沿（激发态的形成）和下降沿（激发态衰减）部分。激发态的形成是由光激发产生的，其上升沿的快慢是由激发态的形成机制（如直接激发或者能量转移等）和仪器的响应函数（IRF, instrument response function）决定的。其中，仪器的IRF决定了荧光寿命探测的时间分辨率，我们将在后面做详细说明。荧光寿命衰减部分可由公式（4）表述。通过指数拟合衰减曲线，即可获得样品的荧光衰减速率常数k0或者荧光寿命τ0=1/k0。**由此可见，荧光寿命检测中所获得荧光寿命τ0是激发态所有衰减通道（包括辐射和非辐射）速率常数的总和，而非只探测辐射复合的速率常数。另外衰减曲线拟合中A0为实验室测得的t=0时刻的Δp值（光子数）。按公式（4）可以得出A0应该为A0 = krC0 （此处不考虑探测器的光子探测效率）。对于选定的测试样品，在稳定条件下kr（辐射复合速率）可以认为是一个常数，因此可以认为衰减曲线中的A0正比于C0，即样品中具有k0衰减常数特征的激发态总浓度。
以上原理性说明中，我们是以单指数衰减方程为例。然而在实际检测过程中，多数样品展现为双指数甚至三指数的衰减过程。个人认为多指数衰减过程的存在是由于样品的在空间和时间尺度上的非均匀性（inhomogeneous）造成的。空间上的非均匀性是指宏观样品中所包含的无数发光个体（如单个分子或单个纳米颗粒）存在着彼此之间的差异（个体本身或者其微观环境）。对于样品中单个发光个体而言，其所处的微观环境可能是千差万别的，例如缺陷态的分布不均匀、温度不均匀、表界面分布不均匀等，由此造成样品中发光个体的k0并非完全相同，而是存在一个分布，从而使得宏观样品的荧光寿命曲线体现为众多个体平均后的多指数衰减过程。此外，在样品的荧光寿命采集过程中，由于环境条件的波动或者某些物理过程的发生，也会引起样品在不同的采集时刻下展现出不同的荧光寿命，导致最终的荧光寿命曲线表现为多指数的过程。我们通过公式（5）多指数方程拟合，可以推算不同荧光寿命组份的荧光寿命值（k1, k2 …）及各组分在整体寿命曲线中的贡献（A1, A2…）：
此外，上述说明中是以一级反应（e指数）为例的，将激发态物种视作一个整体（如单线态或者激子）。如果发光是由自由电子和空穴复合产生，其荧光寿命衰减曲线需要用二级反应（幂指数）来表达，即：
其动力学过程较为复杂，相关研究请参考相应的文献资料，这里不再多述。
02荧光寿命探测的技术原理
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) （时间相关单光子计数）是目前最为广泛使用的荧光寿命测试方法。首先需要明确，荧光寿命曲线是大量光子统计的结果。假设一个宏观（bulk）样品一次激发产生1000个激发态， 如果探测器记录该1000个激发态在激发后不同延迟时刻下的发光强度可以得到样品的荧光寿命曲线。同理，如果探测器（如单光子探测器）一次激发只记录一个光子，重复1000次激发，亦可以得到样品的荧光寿命曲线。TCSPC则是基于该单光子统计的概念而建立的。TCSPC荧光寿命检测设备主要由脉冲激光器、高灵敏度光子探测器和TCSPC卡组成，其探测原理可由图2所示。激光脉冲激发样品产生激发态，随后在t1时刻复合发射荧光光子被探测器采集。该t1时间则为该次激发TCSPC记录下来的激光脉冲信号和荧光信号之间的时间差（微时间，micro-time）。然而TCSPC探测中，不是每一个激光脉冲都可以产生被采集的荧光光子（受到样品荧光量子效率和设备采集效率等因素限制，例如检测器记录的单位时间光子数（counts/s）通常比激光重频低1-2个数量级），因此为了只记录产生荧光光子的微时间（可节省大量内存），TCSPC卡记录的是荧光信号和与其相邻的下一个激光脉冲信号的时间差（图2中的t1′ ），然后基于激光脉冲时间周期T（在选的激光重频下T为固定值），则可以得到t1 = T – t’1。对所采集的大量光子的微时间（t1， t2， t3 …） 进行统计计数，则可以得到荧光寿命曲线。
图2. TCSPC荧光寿命探测原理
a：TCSPC卡时间记录原理；b：单个光子时间统计计数构建荧光寿命曲线; c: TCSPC荧光探测仪器结构示意图
TCSPC寿命曲线中荧光光子的微时间统计计数是基于其通道个数来完成的。如果设定采集时间窗口为100 ns，通道数为4096，荧光寿命曲线中的时间点间隔则为100 ns/4096 = 24.4 ps， 该时间即为图1和图2中的bin time (∆t)，荧光寿命曲线中的时间轴时间记录点则为0，24.4, 48.8, 73.2 ···。TCSPC卡则根据每个光子的微时间，完成在每个∆t间隔内的光子个数的统计，构建荧光寿命曲线。基于TCSPC的采集原理，该方法通常可具有较高的时间分辨率，且更适用于激光器重频的较高的条件下使用。当激光器重频较低时（如< 1KHz）, 其荧光寿命的采集效率将比较低（单位时间内采集的光子数少）。尤为需要注意的是该∆t（bin time）时间并不是荧光寿命探测的时间分辨率，只代表TCSPC卡的计时精度！
此外，TCSPC检测中也存在一个宏时间的概念，该时间是记录荧光光子相对于实验采集开始时刻的时间，与荧光寿命中光子微时间具有本质差别。TCSPC卡对光子微时间（时间差）的探测精度可以达到< 10 ps，而宏时间的记录精度通常在微秒量级。
基于以上原理构建的TCSPC荧光探测仪器的基本结构可由图2c所示，主要包括激光器、探测器和TCSPC卡等核心部件。激光器和探测器在发射激光和探测到光子时会输出同步的电信号，由TCSPC卡检测，获取和计算每个荧光光子的微时间和宏时间，统计构建荧光寿命曲线。
在荧光寿命采集中，我们也会经常看到荧光寿命曲线并不是从时间窗口的0时刻开始的， 而是存在一个延时Td （如图3所示）。在荧光寿命检测中，TCSPC卡是通过记录激光器和探测器的同步输出电信号获取光子的微时间，电子设备的响应时间和电信号在线路中的传输时间则会造成同步电信号与实际的光信号之间存在一个固有的时间差，从而导致荧光寿命时间窗口中的延时。该延时不影响荧光寿命的采集，但会降低时间窗口范围的利用率。延时时间的大小可以通过改变电信号传输线的长度或设定电信号延迟参数等进行调节。
图3. 荧光寿命采集中的延时现象及其产生的原因
除了TCSPC技术之外，荧光寿命也可以通过示波器实现采集。与TCSPC中一次脉冲激发最多只记录一个光子时间不同，示波器可以实现一个脉冲激发后对荧光强度进行高速连续采集来获取荧光寿命曲线，其时间扫描的精度由示波器的带宽（注意不是采样率）决定。例如，500M带宽的示波器可以实现2ns精度的时间扫描，远低于TCSPC。而更高带宽的示波器（如GHz以上）价格则非常昂贵。因此，由于受到带宽的限制，示波器方法多适用于较长荧光寿命的样品（如磷光）和激光重频较低条件下的检测。
03荧光寿命探测中的核心参数
要实现荧光寿命的准确采集和分析，需要首先明确荧光探测中的若干核心参数，主要包括时间分辨率，时间窗口范围和时间精度等。
1）时间分辨率和仪器响应函数（IRF）
时间分辨率是荧光寿命检测技术最为重要的参数，是由探测系统（包括激光器、检测器和TCSPC卡）整体的仪器响应函数（instrument response function, IRF）决定的。**仪器中所使用的激光器、探测器和TCSPC卡等电子元器件都存在光信号转化为电信号的时间响应（response time）和电信号的时间抖动（jitter），此外激光器也存在着激光脉宽（pulse width）的问题，以上因素决定了IRF的大小。TCSPC荧光检测中，TCSPC卡的计时精度可以达到 <10 ps, 通常远高于激光器和探测器。因此TCSPC荧光探测系统的IRF主要来自于激光器和探测器。
在激光器方面，贡献IRF的因素主要包括激光器的脉宽和同步电信号的jitter，如图4所示。激光脉宽是脉冲激光器的最重要参数之一， 由脉冲在时间上展宽的FWHM（full width half maximum）值表现（图4）。此外，TCSPC卡是通过采集激光器的脉冲同步电信号（SYNC）来获取激光器的重频和周期时间T的，在同步电信号中则会带来每个脉冲电信号之间的时间抖动jitter。即电信号中的脉冲周期并不是精准的T时间，而是T + jitter时间。根据荧光光子的微时间（图2 中t1，t2）计算方法t1 = T – t’1, T时间上的jitter（即使远小于T）也会带入到t1时间上，从而贡献到仪器相应函数上。
图4. 激光器对IRF贡献，主要来自于激光脉宽和同步电信号的时间抖动（jitter）
目前TCSPC探测中所使用激光器的脉宽可以有fs， ps和ns等多种选择。其同步电信号的jitter 通常在百ps左右量级。当激光器脉宽远大于jitter时（如ns激光器），其IRF贡献主要来自于脉宽，当jitter时间远大于激光器脉宽时（如fs激光器），其IRF贡献主要来自jitter。两者接近时（如ps激光器）则为其共同作用。
在探测器方面，同样存在着与上述情况类似的探测器响应时间和电信号时间抖动等问题（如图5所示）。当探测器探测到光子时，会输出相应的电脉冲信号，该电信号上升沿代表探测器的响应时间（渡越时间，transient time）；在TCSPC检测中，会设定一个信号阈值 （TH），来甄别有效的电脉冲信号，然后通过恒比鉴别器（constant fraction discriminator）准确记录光子到达探测器的时间，而不受强度波动的影响。探测器的渡越时间本身原则上并不贡献仪器的IRF。然而在重复的光子检测过程中，对于那些即使在相同时刻到达检测器的光子，其输出的电信号存在彼此之间时间上的分布和偏差，即渡越时间展开（transient time spread）（见图5），形成了探测器的时间抖动（jitter），从而贡献到整个系统的IRF中。
图5. 探测器的时间抖动对IRF的贡献。探测器探测光子后产生脉冲电信号，通过设定的电信号阈值来确定光子达到检测的时间。然后由于渡越时间展开的存在，造成了电信信号电信号的时间抖动（jitter）
目前，商业化的仪器设备中多采用单光子探测器和PMT等检测器，其中多数单光子探测器jitter通常可以达到100 ps以下，而常规的PMT探测器的jitter可以达到1-2 ns，特殊的微通道板（MCP）PMT或者混合式PMT可以达到100ps以下。因此，笔者认为，当系统采用常规PMT探测器时，将只适用较长荧光寿命样品的检测。
由此可见，荧光寿命系统的整体IRF由激光器和探测器组成，其数值可由下面的理论公式决定：
在实验中，所使用的荧光探测系统的IRF可以通过直接探测激光的散射信号获得，如图6所示。IRF数值可定义为所测定的IRF曲线的FWHM值。IRF值越小则代表着仪器的时间分辨率更高。
图6. 荧光寿命探测器系统的IRF
因此，我们在实验中所测得荧光寿命曲线是IRF与荧光信号的卷积（convolution）在一起的结果（图7a）。**由于IRF直接决定了荧光寿命探测的时间分辨率，因此其大小对荧光寿命的采集结果和分析产生巨大的影响。**在实验操作前，需要对设备IRF的大小是否适合测量所检测样品的荧光寿命做出判断。如图7b所示，对于相同样品的测试，IRF小的设备测试结果会展现出一个较快且尖锐的上升沿过程，而IRF较大的设备测试结果会表现出较慢且圆滑的上升沿过程。如果荧光寿命衰减过程中包含一个较快的衰减组份，只有IRF小的设备才可能有效采集到该快组份（IRF小于快组份寿命），然而IRF大的设备，由于时间分辨率的限制，很可能无法探测到该快衰减组份的存在（例如IRF远大于快衰减组份寿命情况），从而对检测结果的分析造成巨大的偏差。例如，我们通常通过对荧光寿命检测来判断样品中的缺陷态浓度的高低。样品中缺陷态浓度较高会导致快速的荧光寿命衰减，如果此时用IRF较大的设备进行荧光采集，则很有可能无法实现对可能存在的快速衰减过程的探测，从而造成对样品缺陷态浓度的错误判断。此外，样品中的电荷转移、能量转移等过程以及某些分子和半导体材料也会产生或具有荧光的快速衰减过程，对该类过程和材料的荧光动力学研究，也应采用IRF较小的荧光寿命检测设备。
图7. a）实验中所测得荧光寿命曲线是IRF与荧光信号的卷积（convolution）的结果。b)IRF的大小对荧光寿命曲线的影响。IRF大的设备，受到时间分辨率的限制，可能无法探测荧光寿命衰减中的快组份。
针对样品荧光寿命小于IRF的情况， 我们可以通过数据拟合中去卷积（de-convolution）的方法提取荧光寿命。通过模拟，我们发现去卷积的方法最高可以准确提取IRF/5 的荧光寿命（例如IRF = 200 ps， 去卷积可最快可拟合准确到~40 ps）。目前，某些商业化的仪器厂商将去卷积推算极限设定到IRF/10，并定义为仪器的时间分辨率，笔者认为这样的做法是夸大且有失精准的。去卷积的结果毕竟是来源于数学方法的推算，而不是精准的探测，其结果只能对小于IRF的荧光寿命做出大概的推算。而更精准的检测，应采用超快荧光上转换、超快条纹相机等具有更高时间分辨率的检测设备。
此外，需要再次强调的是荧光寿命探测技术的时间分辨率是系统整体的IRF时间决定的，而不是荧光寿命曲线中的bin time （图1中的∆t）或者TCSPC卡的微时间计时精度。**该∆t和计时精度仅仅反应的是TCSPC卡的时间分辨能力，而不是包括激光器和探测器的整体荧光探测系统的IRF。由于激光器和探测器的IRF通常远大于TCSPC的计时精度，整体系统的IRF则受限于激光器和探测器。
目前，商业化的荧光寿命探测设备都有具有不同激光器和探测器等配置的选择。总结来看，针对时间分辨率参数而言，我们选择仪器配置时应关注以下几点：
- 激光器脉宽是多少
- 激光器同步信号的jitter时间
- 探测器的jitter时间
- TCSPC卡计时精度和通道数等信息
最终系统的IRF将大于或等于以上参数中的最大时间值。
2）探测时间窗口和激光重频
TCSPC荧光寿命检测中的时间窗口范围主要取决于激光器重频，最大时间窗口范围激光器重频的周期时间T。但由于图3中所展示的电信号传输延时的问题，时间窗口范围内有一部分范围被延时时间占据了。通常来讲，时间窗口范围的选择要至少大于荧光寿命2-3倍以上，因此需要跟据样品的荧光寿命来选择合适的激光器重频以及调整电信号延迟等。此外，如果TCSPC是以时间窗口范围除以通道个数来决定荧光寿命曲线的bin time（∆t），此时如果时间窗口过大，将增大bin time值（如∆t ≈或> IRF），从而导致系统的时间分辨率降低。
另一方面，对于TCSPC单光子计数的采集方式而言，如果使用重频过低的激光器，则意味着单位时间内采集的光子数少，将严重降低荧光寿命曲线采集的效率以及信噪比。
04正确展示荧光寿命曲线
如上所述，一个完整的荧光寿命曲线应包括上升沿和下降沿。两部分都具有重要的物理意义。文献报道中经常会看到某些荧光寿命数据的展示忽略了上升沿的部分，本质上是不正确的做法。上升沿代表着样品激发态生成的过程，对于直接激发产生的发光物种可以反映出检测时IRF的大小，可用来判断荧光寿命曲线是否有缺失快衰减组分的可能，亦可用来观测某些样品中的能量转移等过程（或者其它激发态产生过程），如图8所示，因此应给予足够的重视。当然，如果荧光寿命远远大于IRF或者不需关注快过程，此时忽略上升沿也可行。此外，在荧光寿命曲线拟合中，也需要考虑IRF（尤其在荧光寿命较短时），以获得更精准的荧光寿命拟合结果。
图8. 在donor-acceptor共振能量转移过程中，可以通过采集两者的荧光寿命曲线判断能量转移的动力学过程。如果能量转移时间 > IRF，acceptor的荧光寿命曲线展现出慢于IRF的上升沿，同时伴随着donor荧光的快速衰减。
来源：创锐光谱@微信公众号
时间：2022-04-19