Algunas cuestiones clave en las pruebas de duración de la fluorescencia

Jin Shengye, Instituto de Física Química de Dalian, Academia China de Ciencias

La detección del tiempo de vida de la fluorescencia es una de las técnicas más utilizadas para determinar el tiempo de vida del estado excitado y la cinética del portador de una sustancia. La selección y el uso correctos de las técnicas de detección del tiempo de vida de la fluorescencia y la adquisición y el análisis correctos de la cinética del tiempo de vida de la fluorescencia son de especial importancia para determinar las propiedades del estado excitado de las sustancias, las propiedades de los materiales y la cinética de los portadores. En el pasado, a menudo hemos encontrado conceptos erróneos y malentendidos en los parámetros técnicos y el análisis cinético de los equipos de detección del tiempo de vida de fluorescencia, que han llevado a juicios equivocados de las propiedades cinéticas del portador de los materiales en estudio. Por lo tanto, nos gustaría presentar en este breve artículo una breve visión general del significado físico y la comprensión cinética de algunos parámetros técnicos importantes de los dispositivos de fluorescencia.

01Principios básicos de la vida útil de la fluorescencia

La fluorescencia es la absorción de fotones excitados en materiales luminiscentes tras la aparición de saltos de electrones en orbitales de nivel de energía, lo que da lugar a especies de estado excitado (como excitones, cargas libres, etc.) mediante el proceso de composición de radiación emitido por fotones. La fluorescencia encarna el proceso por el cual un material cambia de un estado básico a un estado excitado y posteriormente decae de nuevo al estado básico, y su tiempo de vida de fluorescencia refleja el tiempo de vida del estado excitado del material. Ilustramos este proceso con la molécula C como ejemplo:

La molécula C en estado básico absorbe un fotón excitado y pasa al estado excitado C*, que es el estado excitado Cpuede decaer de nuevo al estado básico por la vía de la radioluminiscencia (kr) o por la vía de la no radioluminiscencia (knr). Según la ecuación de velocidad de reacción primaria, en el momento t tras la excitación, CLa velocidad de decaimiento de

La integración en el tiempo da la concentración de C* en el momento t como

donde C0* es la concentración total de estados excitados en el momento t=0 (es decir, la concentración total de estados excitados producidos por la excitación) y k0= kr + knr.

En los experimentos de detección del tiempo de vida de la fluorescencia, el detector detecta la intensidad de luminiscencia por unidad de tiempo, es decir, la tasa de luminiscencia de la muestra, d(fotón)/dt, así:

En un proceso de detección realista (por ejemplo, utilizando técnicas de recuento de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCSPC)), el detector determina realmente la tasa de luminiscencia recogiendo el número de fotones (ΔP) durante un pequeño periodo de tiempo (bin time, Δt), cuando Δt es suficientemente pequeño:

La curva de vida de fluorescencia obtenida experimentalmente puede verse en la Figura 1.

Figura 1. Diagrama esquemático de una curva típica de vida de fluorescencia

La curva completa del tiempo de vida de la fluorescencia se compone de valores ΔP en intervalos sucesivos Δt (bin time) y consta principalmente de un flanco ascendente (formación del estado excitado) y un flanco descendente (decaimiento del estado excitado). El flanco ascendente viene determinado por el mecanismo de excitación (por ejemplo, excitación directa o transferencia de energía) y la IRF (función de respuesta del instrumento). La IRF del instrumento determina la resolución temporal de la detección del tiempo de vida de fluorescencia, como explicaremos más adelante. El componente de decaimiento del tiempo de vida de fluorescencia puede expresarse mediante la ecuación (4). Ajustando exponencialmente la curva de decaimiento, se obtiene la constante de velocidad de decaimiento de fluorescencia k0 o el tiempo de vida de fluorescencia τ0 = 1/k0 para la muestra.** De ello se deduce que el tiempo de vida de fluorescencia τ0 obtenido en la detección del tiempo de vida de fluorescencia es la suma de las constantes de velocidad de todos los canales de decaimiento (tanto radiativo como no radiativo) en el estado excitado y no sólo la constante de velocidad del complejo de radiación detectado.También el A0 en el ajuste de la curva de desintegración es el valor Δp (número de fotones) medido en el laboratorio en el momento t = 0. Por la ecuación (4) se puede deducir que A0 debe ser A0 = krC0 (Aquí no se considera la eficiencia de detección de fotones del detector). Para la muestra de ensayo seleccionada, kr (la tasa de complejo de radiación) puede considerarse una constante en condiciones estables, de modo que A0 en la curva de decaimiento puede considerarse proporcional a C0, la concentración total de estados excitados en la muestra con la constante de decaimiento k0 característica.

En la descripción esquemática anterior, hemos utilizado como ejemplo la ecuación de decaimiento exponencial simple. Sin embargo, en la práctica, la mayoría de las muestras muestran un proceso de decaimiento exponencial doble o incluso triple. Creo que la existencia de procesos de decaimiento multiexponencial se debe a la naturaleza no homogénea de las muestras tanto a escala espacial como temporal. La no homogeneidad espacial se refiere a las diferencias entre los numerosos individuos luminosos (por ejemplo, moléculas individuales o nanopartículas individuales) contenidos en una muestra macroscópica (los propios individuos o su entorno microscópico). Para un solo individuo luminiscente de una muestra, el entorno microscópico en el que se encuentra puede ser muy diferente, por ejemplo, la distribución de los estados de defecto no es uniforme, la temperatura no es uniforme, la interfaz de superficie no es uniforme, etc., lo que da lugar a que el k0 de los individuos luminiscentes de la muestra no sea exactamente el mismo, sino que existe una distribución, de modo que la curva de tiempo de vida de fluorescencia de la muestra macroscópica refleja el proceso de decaimiento multiexponencial tras la media de muchos individuos. Además, durante el proceso de adquisición del tiempo de vida de fluorescencia, las fluctuaciones en las condiciones ambientales o la ocurrencia de ciertos procesos físicos también pueden causar que la muestra muestre diferentes tiempos de vida de fluorescencia en diferentes momentos de adquisición, dando como resultado que la curva final del tiempo de vida de fluorescencia muestre un proceso multiexponencial. Ajustando la ecuación multiexponencial de la Ec. (5), podemos derivar los valores del tiempo de vida de fluorescencia (k1, k2 ...) de los diferentes componentes del tiempo de vida de fluorescencia y la contribución de cada componente a la curva global del tiempo de vida (A1, A2 ...) como sigue:

Además, la descripción anterior se hace en términos de una reacción primaria (índice e), tratando la especie de estado excitado como un todo (por ejemplo, un único estado lineal o un excitón). Si la luminiscencia es producida por un complejo de electrones y huecos libres, la curva de decaimiento del tiempo de vida de la fluorescencia debe expresarse en términos de la reacción de segundo orden (exponente de potencia), es decir

Los procesos cinéticos son complejos, por lo que se recomienda consultar la bibliografía correspondiente para los estudios relacionados, que no se describirán aquí.

02Principios técnicos de la detección de la vida útil de la fluorescencia

El recuento de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCSPC) es el método de ensayo de la vida útil de fluorescencia más utilizado en la actualidad. En primer lugar, debe quedar claro que la curva de vida de fluorescencia es el resultado de un gran número de recuentos de fotones. Suponiendo que una muestra macroscópica (a granel) produzca 1000 estados excitados en una excitación, si el detector registra la luminiscencia de estos 1000 estados excitados en diferentes tiempos de retardo tras la excitación, se puede obtener la curva de vida de fluorescencia de la muestra. El TCSPC se basa en el concepto de estadística de fotón único y consta de un láser pulsado, un detector de fotones de alta sensibilidad y una tarjeta TCSPC, cuyo principio puede verse en la figura 2. El pulso láser excita la muestra para producir un estado excitado, seguido de una emisión compleja de fotones fluorescentes en el tiempo t1 que es captada por el detector. El tiempo t1 es la diferencia de tiempo (microtiempo) entre la señal del pulso láser y la señal de fluorescencia registrada por el TCSPC para esa excitación. Sin embargo, en la detección TCSPC, no todos los pulsos láser pueden producir los fotones de fluorescencia que se van a recoger (limitado por factores como la eficiencia cuántica de la fluorescencia de la muestra y la eficiencia de adquisición del dispositivo, por ejemplo, el número de fotones por unidad de tiempo (cuentas/s) registrado por el detector suele ser 1-2 órdenes de magnitud inferior a la refrecuencia láser), por lo que para registrar sólo el microtiempo de la producción de fotones de fluorescencia (lo que ahorra mucha memoria), la tarjeta TCSPC registra los fotones de fluorescencia. La tarjeta TCSPC registra la diferencia de tiempo entre la señal de fluorescencia y la siguiente señal de pulso láser adyacente a ella (t1′ en la Fig. 2) y, a continuación, basándose en el período de tiempo de pulso láser T (T se fija en la refrecuencia láser elegida), es posible obtener t1 = T - t'1. Los microtiempos del gran número de fotones recogidos (t1, t2, t3 ...) se evalúan entonces de la siguiente manera La curva del tiempo de vida de la fluorescencia se obtiene contando los microtiempos (t1, t2, t3 ...) del gran número de fotones recogidos.

Figura 2. Principio de detección de la vida útil de la fluorescencia TCSPC

a: Principio del registro del tiempo de la tarjeta TCSPC; b: Recuento estadístico de los tiempos de fotones individuales para construir curvas de vida de fluorescencia; c: Diagrama esquemático de la estructura del instrumento de detección de fluorescencia TCSPC.

Las estadísticas de microtiempo de los fotones de fluorescencia en la curva de tiempo de vida TCSPC se basan en el número de canales. Si la ventana de tiempo de adquisición se establece en 100 ns y el número de canales es 4096, el intervalo de puntos de tiempo en la curva de vida útil de fluorescencia es 100 ns/4096 = 24,4 ps, que es el tiempo bin (∆t) en las figuras 1 y 2, y los puntos de tiempo del eje temporal en la curva de vida útil de fluorescencia son 0, 24,4, 48,8, 73,2 ---. La curva de vida de fluorescencia se construye contando el número de fotones en cada intervalo ∆t, basándose en el microtiempo de cada fotón. Basado en el principio de adquisición de TCSPC, este método se puede utilizar generalmente con una alta resolución temporal y es más adecuado para su uso a frecuencias de láser más altas. Cuando la frecuencia del láser es baja (por ejemplo, < 1 KHz), el tiempo de vida de la fluorescencia se recoge de forma menos eficiente (menos fotones por unidad de tiempo).Es especialmente importante tener en cuenta que este tiempo ∆t (bin time) no es la resolución temporal de la sonda de tiempo de vida de fluorescencia, ¡sino que sólo representa la precisión temporal de la tarjeta TCSPC!

Además, también existe el concepto de macrotiempo en los ensayos TCSPC, que es el tiempo en el que se registran los fotones fluorescentes en relación con el inicio de la adquisición experimental, y es fundamentalmente diferente del microtiempo de fotones en el tiempo de vida de la fluorescencia. Las tarjetas TCSPC pueden detectar el microtiempo de fotones (diferencia de tiempo) con una precisión de < 10 ps, mientras que el macrotiempo se registra normalmente con una precisión del orden de los microsegundos.

La estructura básica del instrumento de detección de fluorescencia TCSPC basado en el principio anterior puede verse en la Figura 2c, que incluye principalmente componentes básicos como el láser, el detector y la tarjeta TCSPC. El láser y el detector emiten señales eléctricas sincronizadas cuando emiten luz láser y detectan fotones, que son detectados por la tarjeta TCSPC, y el microtiempo y macrotiempo de cada fotón fluorescente se obtienen y calculan para construir una curva de vida de fluorescencia.

En la adquisición del tiempo de vida de fluorescencia, también es frecuente observar que la curva del tiempo de vida de fluorescencia no comienza en 0 en la ventana temporal, sino que tiene un tiempo de retardo Td (como se muestra en la Figura 3). El tiempo de respuesta de la electrónica y el tiempo de transmisión de la señal eléctrica en la línea provocan una diferencia de tiempo inherente entre la señal eléctrica sincrónica y la señal óptica real, lo que da lugar a un retraso en la ventana de tiempo de vida de fluorescencia. Este retraso no afecta a la adquisición del tiempo de vida de fluorescencia, pero reduce la utilización del intervalo de la ventana temporal. El tamaño del tiempo de retardo puede ajustarse cambiando la longitud de la línea de transmisión eléctrica o ajustando el parámetro de retardo eléctrico.

Figura 3. Retrasos en la adquisición del tiempo de vida de fluorescencia y sus causas

Además de la técnica TCSPC, los tiempos de vida de fluorescencia también pueden adquirirse mediante osciloscopios. A diferencia de la TCSPC, en la que se registra como máximo un tiempo de fotón para una excitación de pulso único, los osciloscopios pueden lograr una adquisición continua de alta velocidad de la intensidad de fluorescencia tras una excitación de pulso único para obtener curvas de tiempo de vida de fluorescencia, estando determinada la precisión del barrido temporal por el ancho de banda (obsérvese que no por la frecuencia de muestreo) del osciloscopio. Por ejemplo, un osciloscopio con un ancho de banda de 500M puede lograr un barrido temporal de 2ns de precisión, muy por debajo del de un TCSPC, mientras que los osciloscopios de mayor ancho de banda (por ejemplo, por encima de GHz) son muy caros. Por lo tanto, debido a las limitaciones del ancho de banda, el método del osciloscopio es adecuado sobre todo para muestras con largos tiempos de vida de la fluorescencia (por ejemplo, fosforescencia) y para la detección en condiciones de baja refrecuencia del láser.

03Parámetros fundamentales en la detección de la vida útil de la fluorescencia

Para lograr una adquisición y un análisis precisos de los tiempos de vida de la fluorescencia, es necesario definir primero una serie de parámetros fundamentales en la detección de fluorescencia, entre los que se incluyen principalmente la resolución temporal, el intervalo de la ventana temporal y la precisión temporal.

1) Resolución temporal y función de respuesta del instrumento (IRF)

La resolución temporal es el parámetro más importante en la tecnología de medición de la vida útil de la fluorescencia y viene determinada por la función de respuesta global del instrumento (IRF) del sistema de detección (incluidos el láser, el detector y la tarjeta TCSPC). **La IRF viene determinada por el tiempo de respuesta y la fluctuación de la señal eléctrica del láser, el detector y la tarjeta TCSPC, así como por la anchura de pulso del láser. En las tarjetas TCSPC, la precisión de temporización puede alcanzar <10 ps, que suele ser mucho mayor que la de los láseres y detectores. Por lo tanto, el IRF de los sistemas de detección de fluorescencia TCSPC se deriva principalmente del láser y el detector.

En el caso de los láseres, los principales factores que contribuyen a la IRF son la anchura de pulso del láser y la fluctuación de la señal eléctrica síncrona, como se muestra en la figura 4. La anchura de pulso del láser es uno de los parámetros más importantes de un láser pulsado y se expresa mediante el valor FWHM (full width half maximum) de la dispersión del pulso en el tiempo (Figura 4). Además, la tarjeta TCSPC adquiere la refrecuencia del láser y el tiempo de ciclo T mediante la adquisición de la señal eléctrica síncrona pulsada (SYNC) del láser, lo que introduce una fluctuación de tiempo entre cada señal eléctrica pulsada, es decir, el periodo de pulso en la señal eléctrica no es un tiempo T preciso, sino T + tiempo de fluctuación. Según el cálculo del microtiempo de los fotones fluorescentes (t1, t2 en la Fig. 2) t1 = T - t'1, la fluctuación en el tiempo T (aunque sea mucho menor que T) se traslada al tiempo t1 y contribuye así a la función correspondiente del instrumento.

Figura 4. Contribución del láser a la IRF, principalmente por la anchura del pulso láser y la fluctuación temporal (jitter) de la señal eléctrica síncrona

Las anchuras de pulso de los láseres utilizados actualmente en el sondeo TCSPC pueden elegirse entre fs, ps y ns. La fluctuación de la señal eléctrica síncrona suele ser del orden de un centenar de ps. Cuando la anchura del pulso láser es mucho mayor que la fluctuación (por ejemplo, láseres ns), la contribución IRF procede principalmente de la anchura del pulso, cuando el tiempo de fluctuación es mucho mayor que la anchura del pulso láser (por ejemplo, láseres fs), la contribución IRF procede principalmente de la fluctuación, y cuando ambos están próximos (por ejemplo, láseres ps), es su efecto combinado.

En el caso de los detectores, también existen problemas de tiempo de respuesta del detector y de fluctuación temporal de la señal eléctrica similares a los descritos anteriormente (como se muestra en la Figura 5). Cuando el detector detecta un fotón, emite una señal de impulso eléctrico correspondiente, cuyo flanco ascendente representa el tiempo de respuesta (tiempo transitorio) del detector; en la detección TCSPC, se establece un umbral de señal (TH) para discriminar entre impulsos eléctricos válidos, que luego son registrados con precisión por un discriminador de fracción constante discriminador para registrar el tiempo exacto de llegada de los fotones al detector, independientemente de las fluctuaciones de intensidad. El tiempo de tránsito del detector en sí no contribuye en principio al IRF del instrumento, sin embargo, durante la detección repetitiva de fotones, para aquellos fotones que llegan al detector incluso en el mismo momento, se produce una distribución temporal y una desviación de la señal eléctrica de salida entre sí, es decir, una dispersión temporal transitoria (véase la Fig. 5), lo que da lugar a un jitter temporal en el detector. jitter), que contribuye a la IRF de todo el sistema.

Figura 5. Contribución de la fluctuación temporal del detector al IRF. El detector detecta el fotón y genera una señal eléctrica pulsada, y el momento en que el fotón alcanza la detección viene determinado por un umbral de señal eléctrica establecido. La fluctuación temporal de la señal eléctrica de la señal de telecomunicación se debe entonces a la presencia del desdoblamiento del tiempo de transición (fluctuación)

En la actualidad, los detectores como los detectores de fotón único y los PMT se utilizan principalmente en la instrumentación comercial, donde la mayoría de las fluctuaciones de los detectores de fotón único pueden alcanzar normalmente menos de 100 ps, mientras que los detectores PMT convencionales pueden alcanzar fluctuaciones de 1-2 ns, y los PMT especiales de placa de microcanal (MCP) o los PMT híbridos pueden alcanzar menos de 100 ps. Por lo tanto, en opinión del autor, cuando el sistema utilice detectores PMT convencionales, sólo será adecuado para la detección de muestras de mayor tiempo de vida de la fluorescencia.

De ello se deduce que el IRF global de un sistema de tiempo de vida de fluorescencia consta de un láser y un detector, cuyo valor puede determinarse mediante la siguiente ecuación teórica:

El IRF del sistema de detección de fluorescencia utilizado en el experimento puede obtenerse detectando directamente la señal de dispersión del láser, como se muestra en la figura 6. el valor de IRF puede definirse como el valor FWHM de la curva IRF medida. un valor de IRF menor representa una mayor resolución temporal del instrumento.

Figura 6. IRF del sistema detector de vida de fluorescencia

Por lo tanto, la curva de tiempo de vida de fluorescencia que medimos en nuestro experimento es el resultado de la convolución (resolución) del IRF con la señal de fluorescencia (Figura 7a). **Dado que el IRF determina directamente la resolución temporal de la detección del tiempo de fluorescencia, su tamaño tiene un gran impacto en los resultados y el análisis de la adquisición del tiempo de fluorescencia. **Antes de la operación experimental, es necesario juzgar si el tamaño del IRF del dispositivo es adecuado para medir el tiempo de vida de fluorescencia de la muestra examinada. Como se muestra en la Figura 7b, para la misma muestra, un dispositivo con un IRF pequeño mostrará un proceso de flanco ascendente más rápido y agudo, mientras que un dispositivo con un IRF más grande mostrará un proceso de flanco ascendente más lento y suave. Si el proceso de decaimiento del tiempo de vida de la fluorescencia contiene un componente de decaimiento rápido, sólo un dispositivo con un IRF pequeño puede captar eficazmente el componente rápido (IRF menor que el tiempo de vida del componente rápido), sin embargo, un dispositivo con un IRF grande, debido a las limitaciones de resolución temporal, es probable que no detecte la presencia del componente de decaimiento rápido (por ejemplo, si el IRF es mucho mayor que el tiempo de vida del componente de decaimiento rápido), lo que da lugar a un sesgo significativo en el análisis. Esto puede causar un sesgo significativo en el análisis de los resultados. Por ejemplo, es habitual determinar la concentración de estados defectuosos en una muestra examinando el tiempo de vida de la fluorescencia. Una alta concentración de estados defectuosos en una muestra dará lugar a un rápido decaimiento del tiempo de vida de fluorescencia, y si la fluorescencia se recoge con un dispositivo con un IRF grande, es probable que no se consiga la detección del posible proceso de decaimiento rápido, lo que dará lugar a una determinación incorrecta de la concentración de estados defectuosos en la muestra. Además, procesos como la transferencia de carga y la transferencia de energía en las muestras, así como determinadas moléculas y materiales semiconductores, también pueden generar o tener procesos de decaimiento rápido de la fluorescencia, y los estudios cinéticos de fluorescencia de dichos procesos y materiales también deben llevarse a cabo utilizando equipos de detección de la vida útil de la fluorescencia con un IRF pequeño.

Figura 7. a) La curva del tiempo de vida de la fluorescencia medida en el experimento es el resultado de la convolución del IRF con la señal de fluorescencia. b) El efecto del tamaño del IRF en la curva del tiempo de vida de la fluorescencia. los dispositivos con un IRF grande, limitados por la resolución temporal, pueden no ser capaces de detectar el componente rápido del decaimiento del tiempo de vida de la fluorescencia.

Para las muestras con tiempos de vida de fluorescencia inferiores al IRF, podemos extraer el tiempo de vida de fluorescencia mediante de-convolución en el ajuste de datos. Mediante simulaciones, hemos descubierto que la de-convolución puede extraer con precisión los tiempos de vida de fluorescencia hasta IRF/5 (por ejemplo, IRF = 200 ps, la de-convolución puede ajustarse tan rápido como ~40 ps). Actualmente, algunos fabricantes de instrumentos comerciales fijan el límite de extrapolación de la deconvolución en IRF/10 y lo definen como la resolución temporal del instrumento, lo cual me parece exagerado e inexacto. Al fin y al cabo, los resultados de la deconvolución se derivan de métodos matemáticos más que de una detección precisa, y sólo pueden dar una estimación aproximada de los tiempos de vida de fluorescencia inferiores a IRF. Debería conseguirse una detección más precisa utilizando equipos de detección con mayor resolución temporal, como la upconversión de fluorescencia ultrarrápida y las cámaras streak ultrarrápidas.

Además, hay que volver a insistir en que la resolución temporal de la técnica de detección del tiempo de vida de la fluorescencia viene determinada por el tiempo IRF del sistema en su conjunto, no por el tiempo bin de la curva del tiempo de vida de la fluorescencia (∆t en la Figura 1) ni por la precisión de microtemporización de la tarjeta TCSPC. **Dado que el IRF del láser y del detector suele ser mucho mayor que la precisión de temporización del TCSPC, el IRF del sistema en su conjunto está limitado por el láser y el detector.

En la actualidad, existen en el mercado dispositivos de detección de la vida útil de la fluorescencia con distintas configuraciones, como diferentes láseres y detectores.En resumen, para el parámetro de resolución temporal, debemos centrarnos en los siguientes puntos a la hora de elegir la configuración de un instrumento:

• ¿Cuál es la anchura de pulso del láser
• tiempo de fluctuación de la señal de sincronización láser
• Tiempo de fluctuación del detector
• Información sobre la precisión de temporización de la tarjeta TCSPC y el número de canales

El IRF final del sistema será mayor o igual que el valor de tiempo máximo en los parámetros anteriores.

2) Ventana temporal de detección y frecuencia del láser

El intervalo de la ventana temporal en la detección del tiempo de vida de la fluorescencia TCSPC depende principalmente de la refrecuencia láser, siendo el tiempo máximo de la ventana temporal el tiempo de ciclo de la refrecuencia láser T. Sin embargo, debido al retardo en la transmisión de la señal eléctrica que se muestra en la Figura 3, parte del intervalo de la ventana temporal está ocupado por el tiempo de retardo. En términos generales, el intervalo de la ventana de tiempo debe elegirse para que sea al menos 2-3 veces mayor que el tiempo de vida de la fluorescencia, por lo que es necesario elegir la refrecuencia láser adecuada y ajustar el retardo de la señal eléctrica, etc., de acuerdo con el tiempo de vida de la fluorescencia de la muestra. Además, si el TCSPC determina el tiempo bin (∆t) de la curva de tiempo de vida de fluorescencia dividiendo el número de canales por el rango de la ventana de tiempo, una ventana de tiempo grande aumentará el valor del tiempo bin (por ejemplo, ∆t ≈ o > IRF) y dará lugar a una reducción de la resolución temporal del sistema.

Por otro lado, para el método de adquisición de recuento de fotones individuales TCSPC, utilizar un láser con una refrecuencia demasiado baja significa que se adquieren menos fotones por unidad de tiempo, lo que reducirá seriamente la eficacia de la adquisición de la curva de tiempo de vida de fluorescencia, así como la relación señal/ruido.

04Presentación correcta de las curvas de vida de fluorescencia

Como se ha mencionado anteriormente, una curva completa de vida de fluorescencia debe incluir un flanco ascendente y un flanco descendente. Ambos componentes son físicamente significativos. Es común ver en la literatura ciertas presentaciones de datos de tiempo de vida de fluorescencia que omiten el componente del flanco ascendente, lo cual es inherentemente un enfoque incorrecto. El flanco ascendente representa el proceso de generación del estado excitado en la muestra, y para las especies luminiscentes directamente excitadas puede reflejar el tamaño del IRF en el momento de la detección, y puede utilizarse para determinar si a la curva de tiempo de vida de fluorescencia le falta un componente de decaimiento rápido, o para observar procesos como la transferencia de energía (u otros procesos de generación del estado excitado) en algunas muestras, como se muestra en la Figura 8, y por lo tanto debe prestársele la debida atención. Por supuesto, si el tiempo de vida de la fluorescencia es mucho mayor que el IRF o si el proceso rápido no es de interés, es posible ignorar el flanco ascendente en este punto. Además, es necesario tener en cuenta el IRF en el ajuste de la curva de tiempo de vida de fluorescencia (especialmente cuando el tiempo de vida de fluorescencia es corto) para obtener resultados de ajuste del tiempo de vida de fluorescencia más precisos.

Figura 8. La cinética de la transferencia de energía puede determinarse recogiendo las curvas de vida de fluorescencia de ambos durante la transferencia de energía de resonancia donante-aceptante. Si el tiempo de transferencia de energía > IRF, la curva de tiempo de vida de fluorescencia del aceptor muestra un borde ascendente más lento que el IRF, acompañado de un rápido decaimiento de la fluorescencia del donante.

Fuente: Tristar Spectrum @ WeChat
CUÁNDO:2022-04-19