Cribado automatizado y reproducible de anticuerpos HLA en el trasplante de órganos mediante el dispensador MANTIS

Fondo

El sistema de antígenos leucocitarios humanos (HLA) forma parte de nuestro sistema inmunitario adaptativo y desempeña un papel importante tanto en la defensa contra las enfermedades como en el trasplante de órganos. Los donantes con marcadores HLA compatibles tienen menos probabilidades de rechazar un órgano.

Investigadores del Laboratorio de Inmunología Médica (LMI) del Centro Médico de la Universidad Radboud (Países Bajos) realizan un cribado para detectar anticuerpos específicos HLA en el suero de posibles receptores de órganos. La detección de anticuerpos contra marcadores HLA es necesaria para evitar el rechazo hiperagudo del órgano donado. El rechazo puede deberse a transfusiones de sangre, trasplantes o embarazos. El laboratorio realiza cribados trimestrales para detectar estos anticuerpos nocivos en el suero de los pacientes.

Estos anticuerpos pueden detectarse cruzando el suero de un paciente con una suspensión de más de 60 linfocitos únicos de diferentes individuos con distintos marcadores HLA. Esto también se conoce como prueba de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En este estudio, se utilizó el procesador de líquidos MANTIS® de FORMULATRIX® para dispensar los linfocitos aislados en las placas Terasaki preparadas.

Materiales y métodos

En primer lugar, se dispensó 1 μl de suero del paciente en una placa Terasaki (Greiner) utilizando un dispensador de suero ART Robbins (Sunnyvale, CA). Los linfocitos del donante se aislaron de la sangre utilizando el método de gradiente de densidad Lymphoprep (Elitech Group) o nitrógeno líquido, después se cultivaron y se lavaron con colorante CFDA C195 (Invitrogen). A continuación se preparó una suspensión de linfocitos de 4 x 106 células por ml.

El dispensador MANTIS® se utiliza para dispensar 1 μL de linfocitos aislados en placas Terasaki preparadas. Los pasos posteriores incluyen la adición de suspensiones de complemento de conejo (Immucore, Norcross, GA) y EDTA (Merck, KGaA, Darmstadt, Alemania), hemoglobina y yoduro de propidio, y la incubación.

Tras el último paso de adición, las microplacas se observaron con un microscopio invertido de fluorescencia (Leitz Leica Diavert Inverted Microscope withfluorescent light illuminator (480-525nm) Oculair 10x) para determinar si había una reacción positiva o negativa entre el suero del paciente y los linfocitos del donante. La presencia de una reacción positiva o negativa entre el suero del paciente y los linfocitos del donante.

El porcentaje de destrucción (% kill) se determinó a partir de los resultados de la tinción fluorescente (véase la figura 1). El porcentaje de destrucción es el porcentaje de células positivas (rojas) respecto al número total de células positivas y negativas (verdes). Las puntuaciones porcentuales se muestran en la Tabla 1.

Cuadro 1: Porcentaje de muertes

Fig. 1: Muestra de linfocitos obviamente observable (A) Reacción negativa, verde. (B) Reacción positiva, rojo. (C) Reacción fuertemente positiva, rojo.

Resultados y conclusiones

Como el equipo existente ya no era compatible, el laboratorio tuvo que encontrar un dispensador automático alternativo para añadir linfocitos preparados a las placas Terasaki. La dispensación manual introduce una cantidad variable de variabilidad durante el experimento, lo que resulta inaceptable para el investigador.

Un número cada vez mayor de laboratorios que ya no utilizan equipos compatibles para el cribado de HLA tendrán que sustituir esta tecnología obsoleta, por lo que el equipo del LMI ha accedido a compartir los resultados de su evaluación en beneficio de la comunidad académica más amplia implicada en esta importante labor.

El instrumento MANTIS de FORMULATRIX se considera una técnica superior para añadir linfocitos en comparación con la dosificación manual con pipeta y se ha utilizado con éxito en flujos de trabajo rutinarios de laboratorio. Proporciona resultados en menos tiempo y con mayor consistencia y precisión.

Agradecimientos y reconocimientos

FORMULATRIX® desea agradecer a Yvonne van Berkel (analista senior Cellulaire Immunologie en Histocompatibiliteit) y al equipo de LMI su trabajo en la evaluación del flujo de trabajo HLA del dispensador MANTIS® y los datos proporcionados en esta nota de aplicación. Los resultados de los datos proporcionados en esta nota de aplicación. Los otros miembros del equipo fueron Siham Akdimi, Gaby Derksen, Suzanne Hendriks y Jeroen Slager.

Fuente: @BostonFummerle

Fecha: 2022.02.21