Los organoides permiten a los investigadores estudiar la biología de los tejidos con una fidelidad extraordinaria. Mediante el uso de sistemas de cultivo in vitro en 3D para mostrar características clave de órganos específicos, estas complejas estructuras multicelulares nos han proporcionado conocimientos fisiológicamente relevantes que han ayudado a avanzar en muchas áreas de investigación. Una de las principales limitaciones del cultivo tradicional de organoides es que suele ser un proceso muy laborioso que requiere personal altamente especializado para lograr un rendimiento medio. Gracias al procesador de líquidos MANTIS® de FORMULATRIX, los investigadores del laboratorio Shalek del Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) pudieron analizar rápidamente más de 450 dosis diferentes de pequeñas moléculas para determinar su capacidad de potenciar la diferenciación de las células de Pann en organoides del intestino delgado. El MANTIS® proporciona un nivel de rendimiento previamente inalcanzable y es esencial para avanzar en la comprensión de múltiples cambios en un material de muestra limitado.

La barrera epitelial intestinal es una importante diana terapéutica

Las barreras tisulares formadas por células de la piel, las vías respiratorias y los intestinos proporcionan interacción con el entorno y protección frente a él. Equilibran los niveles de fluidos, nutrientes, electrolitos y residuos metabólicos, colaboran estrechamente con el sistema inmunitario en la defensa frente a agentes patógenos y desempeñan un papel importante en la vigilancia y erradicación de tumores.

La disfunción de la barrera tisular está asociada a una amplia gama de estados patológicos, como infecciones, cáncer, alergias y diversas enfermedades autoinmunes. Aunque las exposiciones ambientales pueden mitigarse con terapias como antivirales y antibióticos, y las respuestas inmunitarias pueden modificarse con vacunas e inmunoterapia, en algunos casos el problema no puede resolverse con los métodos existentes.

Pese a ser un componente clave de la barrera tisular, la barrera epitelial intestinal se ha infrautilizado hasta ahora como diana terapéutica. Mediante el uso de sistemas organoides para modelizar distintas fuentes de tejido de barrera epitelial intestinal, los investigadores pueden comprender mejor estos complejos sistemas y desarrollar así terapias para tratar una amplia gama de enfermedades.

Los modelos orgánicos impulsan la investigación

Los organoides representan uno de los avances más valiosos de los últimos años en la investigación con células madre. Derivados de células madre adultas individuales, muestras de tejidos que contienen células madre adultas o mediante diferenciación dirigida de células madre pluripotentes, los organoides contienen poblaciones de células madre capaces de diferenciarse en tipos celulares específicos de órganos. Estas células presentan una organización espacial y una función similares a las del órgano que representan, dando lugar a sistemas fisiológicamente relevantes que imitan las condiciones in vivo.

Fig. 1. Los órganos análogos presentan una organización espacial y una función similares a las de los órganos representativos, como la morfología cripta/vellosidad de este análogo del intestino delgado.

Estudios sobre organoides limitados por el flujo

Existen varias formas de cultivar organoides. Entre ellas se incluye el cultivo de células madre en presencia de una capa alimentadora de fibroblastos o en la superficie de una matriz biomaterial controlada, pero el método más popular consiste en encapsular células madre en una matriz extracelular (MEC) de origen biológico, como Matrigel®. Al encapsular una cúpula de Matrigel® inoculada en una placa con un medio de cultivo celular que contiene factores de crecimiento específicos, las células proliferan posteriormente para formar una estructura tridimensional que representa el órgano de interés para el investigador.

Figura 2. La cúpula de Matrigel® encapsula las células madre y promueve su proliferación para formar estructuras tridimensionales fisiológicamente relevantes.

La inoculación de placas de organoides en la cúpula de Matrigel® tiene tres requisitos específicos: 1) deposición precisa de ECM que contenga células en placas de cultivo de tejidos precalentadas, evitando los bordes de los pocillos para mantener la forma de cúpula necesaria para un crecimiento máximo; 2) manipulación precisa en volúmenes muy pequeños, ya que el material de muestra suele ser muy limitado; y 3) un grado razonable de control de la temperatura, ya que Matrigel® y sustratos similares existen como líquidos viscosos a 4 °C y requieren una superficie y un entorno cálidos para formar hidrogeles curados.

Debido a estos requisitos, la miniaturización de los cultivos de organoides a una escala compatible con los equipos de cribado convencionales (formatos de 96/384/1536 pocillos) es extremadamente difícil. Aunque el proceso de deposición de Matrigel®, bastante trivial y lento, puede realizarse manualmente en placas de 48 pocillos, las tasas de formación de gotas erróneas aumentan significativamente en volúmenes de placa de pocillos mayores y limitan enormemente la reproducibilidad de los experimentos.

MANTIS® es una solución de sobremesa para la investigación de organoides miniaturizados

Para superar las limitaciones de los métodos manuales de deposición de Matrigel®, los investigadores del laboratorio Shalek del MIT utilizaron el procesador de líquidos MANTIS® de FORMULATRIX para dispensar gotas de Matrigel® en diversos formatos de placa (hasta 384 pocillos). El objetivo de este estudio era completar una campaña de cribado de compuestos utilizando el sistema de organoides del intestino delgado a una escala adecuada para los métodos de alto rendimiento.

MANTIS® utiliza un dispensador microfluídico sin contacto de un solo canal para suministrar reactivos individuales a un único pocillo cada vez, confinando el líquido a chips desechables para evitar la contaminación cruzada y eliminando la necesidad de limpieza. El CV de menos de 31 TP3T, líder del sector, permite suministrar volúmenes precisos de hasta 0,1 µl, al tiempo que ofrece flexibilidad para múltiples flujos de trabajo, ya que admite de 6 a 48 chips y maneja soluciones acuosas de hasta 25 cP (equivalentes a aproximadamente 601 TP3T de glicerol a temperatura ambiente).

Además de estas características, MANTIS ocupa sólo 1 pie3, por lo que puede instalarse fácilmente en entornos con temperatura controlada, como frigoríficos o incubadoras. También es compatible con una amplia gama de software e instrumentos de laboratorio y puede integrarse perfectamente en los flujos de trabajo existentes.

Figura 3. El MANTIS® ocupa muy poco espacio y puede sellarse en un entorno de temperatura controlada. La colocación de MANTIS® en un frigorífico en este experimento permitió la inoculación de placas de Matrigel® en una superficie calentada a 4°C (gris = frío, rojo = caliente). Estas son las condiciones ideales para la formación de una cúpula de Matrigel®.

La miniaturización de los cultivos de organoides del intestino delgado proporciona información clave

Ben Mead, becario posdoctoral del laboratorio de Shalek en el MIT, y sus colegas utilizaron MANTIS® para miniaturizar un flujo de trabajo existente y cribar una biblioteca de compuestos en el sistema de organoides del intestino delgado con el fin de identificar moléculas herramienta que puedan potenciar la diferenciación de las células de Pan. Éstas son las principales células productoras de antimicrobianos del intestino delgado humano y son esenciales para la función de barrera epitelial.

Tras la aplicación de medidas estadísticas sólidas (aún no publicadas), Mead y sus colegas han identificado una serie de compuestos semilleros. Algunos de ellos han pasado a estudios de seguimiento, lo que supone una importante oportunidad para perfilar nuevas dianas biológicas a tener en cuenta para la diferenciación dirigida de las células de Pan.

La ampliación aumenta las oportunidades de la medicina personalizada

Varias características clave del MANTIS® respaldan los hallazgos de los investigadores del MIT. Al dispensar gotas de Matrigel® mediante un único brazo libre, el MANTIS® puede proporcionar una inoculación precisa de placas en diversos formatos (hasta 384 pocillos) para aumentar la escala de los experimentos. El instrumento también puede alojar placas de 1536 pocillos, lo que permite ampliar el rendimiento según sea necesario.

Las puntas de pipeta lavables y desechables conectadas al chip permiten a los investigadores del MIT manejar volúmenes de muestra limitados, al tiempo que reducen las necesidades de reactivos y los costes asociados. Además, el reducido tamaño del MANTIS® permite instalar fácilmente todo el dispositivo en un frigorífico estándar y combinarlo con un bloque de precalentamiento para depositar con precisión gotas de Matrigel® enfriadas sobre la superficie de cultivo tisular precalentada (véase la figura 4); esta inoculación en placa supone una mejora significativa con respecto a la técnica manual.

Figura 4. MANTIS® reduce significativamente los requisitos de reactivos, incluido el volumen de Matrigel® por pocillo, el volumen de medio de inoculación de la placa y el número de organoides intestinales inoculados, al tiempo que reduce el tiempo de inoculación de la placa.

Investigadores del MIT han demostrado que el enfoque miniaturizado que ofrece MANTIS® es eficaz para estudiar múltiples variaciones de materiales limitados. Esto es relevante para la detección de organoides a partir de biopsias de pacientes individuales y abre muchas nuevas oportunidades para la medicina personalizada. La inclusión de modalidades de medición adicionales mejorará aún más la fidelidad del modelo a medida que evolucione la tecnología, y MANTIS® es clave para hacer realidad la necesidad de una mayor escala.

Fuente: @BostonFummerle

Fecha: 2022.01.11