Presentación

La cuantificación de ácidos nucleicos es un paso importante en el flujo de trabajo de la biología molecular, especialmente para aplicaciones avanzadas como la qPCR y la secuenciación de nueva generación (NGS). En la NGS, donde el objetivo final es generar bibliotecas muy complejas y secuenciarlas con la máxima profundidad y homogeneidad, la cuantificación precisa es especialmente importante. Los dos pasos clave para determinar con precisión las concentraciones de ácidos nucleicos son:

1. La eficacia máxima de la enzima es sensible a la cantidad de ADN introducido antes de la preparación de la biblioteca y 2) después de la preparación de la biblioteca para estandarizar las muestras y agruparlas antes de la secuenciación. Además, la necesidad de entradas de muestras cada vez más pequeñas (por ejemplo, para experimentos de ARN-seq) y el reto de aislar ácidos nucleicos de muchos tipos de muestras comunes (por ejemplo, FFPE y ccfADN) dificultan la estimación de la concentración.

Aunque existen varios métodos cuantitativos, los sistemas basados en fluorocromos se recomiendan para las aplicaciones downstream avanzadas debido a su sensibilidad, selectividad de diana, coste y facilidad de uso. Con el sistema QuantiFluor® dsDNA, se diluye una solución madre de colorante fluorescente para formar una solución de trabajo, se añade a una placa de microtitulación que contiene un pequeño volumen de muestra de ADN purificado y se mide la fluorescencia con un fluorómetro. El sensible y preciso sistema QuantiFluor® dsDNA puede utilizarse para cuantificar dsDNA en tubos individuales, así como en placas de 96 y 384 pocillos.

Puede resultar difícil garantizar la precisión durante el pipeteo repetitivo de pequeños volúmenes, y el proceso requiere mucha mano de obra, está sujeto a errores y a costosas repeticiones. MANTIS® es un nuevo procesador de líquidos de sobremesa que satisface muchos de los requisitos de la dispensación de reactivos de alto rendimiento a una fracción del coste de los sistemas más grandes. Para la cuantificación de ácidos nucleicos, el MANTIS® dispensa con precisión pequeños volúmenes de soluciones de trabajo de colorante QuantiFluor® para obtener resultados de cuantificación reproducibles. En esta nota de aplicación, demostramos la compatibilidad del procesador de líquidos MANTIS®, que puede automatizar de forma rápida y precisa la manipulación de reactivos para sistemas QuantiFluor® dsDNA en formatos de placas de 96 y 384 pocillos.

Material necesario

- Instrumento MANTIS® (Formulatrix)

- Chip de alta capacidad (Formulatrix Cat.# MCHS6)

- Sistema QuantiFluor® dsDNA (Cat.# E2670)

- Agua libre de nucleasas (Cat.# P1195)

- Placa negra de fondo plano de 96 pocillos (Corning Cat.# 3915) o placa de 384 pocillos (Corning Cat.# 3573)

- Tubos cónicos de 15 ml o 50 ml

- Detector multipocillo con medición de fluorescencia (por ejemplo, GloMax Discover System [Cat. # GM3000])

Programa experimental

Preparación de reactivos. 

1. Preparación del tampón TE 1X: diluir 20 veces el tampón TE 20X con agua libre de nucleasas.

2. Prepare una solución de trabajo del colorante QuantiFluor® dsDNA.

   a. Formato de 96 pocillos: diluir el colorante QuantiFluor® dsDNA a 1:400 en tampón TE 1X. Véanse las instrucciones detalladas de uso en el manual técnico del sistema QuantiFluor® dsDNA #TM346.

   b. Formato de 384 pocillos: Dilución del colorante según los requisitos analíticos deseados. (Consulte la nota de aplicación High Throughput, Low Volume DNA Quantification with the QuantiFluor® dsDNA System para obtener instrucciones sobre la selección de la dilución de colorante adecuada. ) Aquí utilizamos una dilución 1:200 del colorante QuantiFluor® dsDNA en tampón TE 1X para cuantificar 0,05-50ng de ADN.

3. Preparación de curvas estándar: Se realizaron diluciones seriadas utilizando concentraciones conocidas de estándares de dsADN y tampón TE 1X que se extendían hacia arriba y hacia abajo del rango de concentración de cualquier muestra desconocida. Para las muestras en blanco, se utilizó tampón TE 1X.

Ajustes del instrumento.

1. Abra la aplicación de escritorio MANTIS® y seleccione "Archivo" > "Nueva lista de asignación". Seleccione su tabla de determinación de la lista.
   

2. El software pedirá al usuario que añada el reactivo a la lista de distribución. Introduzca "QuantiFluor dsDNA" en el campo "Nombre del reactivo" y seleccione "Aceptar" cuando haya terminado.
   

3. Asignar QuantiFluor dsDNA a la posición de chip #1
   

4. Coloque la solución de trabajo QuantiFluor® dsDNA en el porta reactivos en la posición del chip #1. Coloque el tubo del chip en el reactivo.

5. Llene el chip y configure la nueva dispensación de fluido seleccionando el orificio deseado e introduciendo el volumen objetivo para el orificio seleccionado

   a. Formato de 96 pocillos: se dispensan 200 µl de solución de trabajo en cada pocillo.

   b. Formato de 384 pocillos: se dispensan 36 µl de solución de trabajo en cada pocillo.
   

6. Añada la microplaca al MANTIS®deck y pulse start.

Determinación analítica:

1. Pipetear manualmente los estándares, los blancos y las muestras desconocidas en sus respectivos pocillos de la placa multipocillos.

   c. Formato de 96 pocillos: añadir 1-20 µl de estándares, blancos y muestras desconocidas.

   d. Formato de 384 pocillos: añadir 4µl de estándar, blanco y muestra desconocida.

2. Mezcle bien las microplacas utilizando un agitador de placas o pipeteando el líquido en cada pocillo. Si no se mezclan bien, las lecturas variarán de un pocillo a otro. Evite también la introducción de burbujas de aire, que pueden interferir con la fluorescencia.

3. Incubar el ensayo a temperatura ambiente durante 5 minutos.

4. Detección de fluorescencia (504nmEx/531nmEm). Si utiliza un instrumento de detección GloMax® Systems, seleccione la opción precargada: "QuantiFluor dsDNA System".

5. Calcule la concentración de dsADN de la siguiente manera: elimine la fluorescencia de la muestra en blanco (tampón TE 1X) de la fluorescencia de cada estándar y muestra. Se generó una curva estándar de fluorescencia frente a la concentración de ADN utilizando los datos de calibración de los estándares de ADN. Determine la concentración de ADN de cualquier muestra desconocida en la curva estándar mediante regresión lineal o regresión de potencia.

Normalización .

1. Los valores de concentración del instrumento de detección GloMax® pueden importarse directamente al software MANTIS® para calcular los volúmenes necesarios para la estandarización (véanse las figuras 1 y 2).

Figura 1. Cuantificación del estándar de ADN genómico humano K562 (Cat.# E4931) utilizando el MANTIS® Liquid Processor para dispensar una solución de trabajo de colorante QuantiFluor® dsDNA en placas de 96 pocillos (Figura A) y placas de 384 pocillos (Figura B). La fluorescencia se midió en el sistema GloMax® Discover y se insertaron muestras desconocidas dentro de la curva estándar de regresión de potencia.

Figura 2. Cuantificación de productos de PCR de 2.200 pb utilizados para simular el tamaño medio de los transcritos de ARNm. Se utilizó el Mantis Liquid Processor para dispensar el sistema QuantiFluor® dsDNA en formato de placa de 96 pocillos (figura A) y en formato de placa de 384 pocillos (figura B). La fluorescencia se midió en el sistema GloMax® Discover y se insertaron muestras desconocidas dentro de la curva estándar de regresión de potencia.

Resumen

El procesador de líquidos MANTIS® proporciona a los investigadores una estación de trabajo flexible para configurar una gran variedad de protocolos experimentales en cuestión de minutos. Ejecute estos protocolos con precisión para mejorar la eficiencia del laboratorio y la reproducibilidad experimental. Esta nota de aplicación demuestra la facilidad de uso del software de manipulación de líquidos, que permite una transición rápida y sin problemas a una plataforma automatizada. El uso del procesador de líquidos MANTIS® para añadir reactivos al sistema QuantiFluor® dsDNA permite una cuantificación reproducible en microplacas multicapa con poca o ninguna programación del instrumento.

Fuente: @BostonFummerle

Fecha: 2022.02.15